喬璐，李博，李慶

鄭州市第一人民醫(yī)院，河南 鄭州 450008

心肌纖維化是由膠原纖維大量積聚、心肌膠原濃度比例失衡引起的[1～2]。心肌成纖維細胞(Cardialfibroblasts，CFs)是心肌組織的重要組成部分，病理增殖分化過度時會大量分泌膠原蛋白，是形成心肌纖維化的病理基礎(chǔ)[3～4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是心肌纖維化形成的重要調(diào)控因子，在作用于CFs后，主要通過TGF-β信號通路中的Smads蛋白，轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達，促進膠原纖維的合成及纖維化的發(fā)展[5～6]。氧化苦參堿(Oxymatrine，OM)為苦參的有效成分，具有抗纖維化、抗炎等作用。既往研究已證實OM對心肌細胞受損有保護作用，且能夠有效治療心肌纖維化[7]。因此，本研究進一步通過OM干預接受TGF-β1刺激的CFs增殖模型，觀察OM對該模型的抑制作用及干預機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物選取出生1～3 d內(nèi)的新生SD大鼠480只，雌雄不限，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥品與試劑 98%OM(陜西帕尼爾生物科技有限公司)；TGF-β1、熒光定量PCR試劑盒、Vimentin兔抗人波形蛋白及Fibronection兔抗體(美國 Pepro Tech公司)；兔抗 PCNA、α-SMA抗體和DABKit(上海瑞齊生物技術(shù)有限公司)；大鼠Ⅰ型膠原纖維(CoL-Ⅰ)、Ⅲ型膠原纖維(CoL-Ⅲ)ELISA試劑盒(上海晶天生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒(北京中杉金橋公司)，Smad2、Smad3 XPRabbit mAb[賽信通(上海)生物試劑有限公司]。

1.3 CFs的培養(yǎng)及鑒定 用75%的乙醇對新生SD大鼠皮膚進行消毒，固定大鼠四肢，剪取心臟前1/3部分組織，洗凈后轉(zhuǎn)存入青霉素小瓶中，剪為大小不超過1 mm3的碎塊，平鋪在培養(yǎng)瓶底，加入含有10%血清的DEME培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)瓶于95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，保證培養(yǎng)基浸過組織塊后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育，每隔1天更換培養(yǎng)液[8]。待細胞生長面積沒過瓶底后進行傳代，將傳代后3代的CFs作為實驗對象。通過免疫細胞化學法染色證實細胞中存在波形蛋白及纖維連接蛋白表達者，為CFs。培養(yǎng)的CFs分為對照組、TGF-β1組及觀察組。

1.4 MTT法檢測CFs增殖情況 細胞接種、步驟同上。對照組(無血清DEME)及TGF-β1組采用濃度為20 ng/mL TGF-β1孵育24 h；先對觀察組采用3.78×10-4mol/L的OM預處理后，再加入濃度為20 ng/mLTGF-β1孵育24 h，通過免疫檢測儀上490 nm波長處測定光吸收值(A490值)，判斷各組CFs增殖情況。

1.5 ELISA法檢測CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量 將所有處理過的CFs消化離心，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)制成細胞懸液，待細胞濃度達到1×106個/mL后，采用復凍融破壞細胞，誘導細胞分泌蛋白，1 500 r/min離心30 min后，用ELISA法檢測CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量，含量越高則表明細胞膠原表達越多，以上操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.6 RT-PCR檢測Smad2 mRNA表達水平 用RNA提取試劑盒提取處理好的CFs的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；嚴格按照YBRPremix Ex Taq試劑盒操作，加入上、下游引物(Smad2上游序列：ACCACTCTCTC-CCCTGTCAAT，下游序列：CAAACCTAAGCAGAAC-CTCTCC；β-actin上游序列：CACCC GCGAG-TACAACCTTC，下游序列：CCCATACCCACC ATCACACC。)進行PCR反應(yīng)。根據(jù) 2－ΔΔCt進行Smad2 mRNA的相對表達量分析。

1.7 Westorn blot檢測α-SMA、PCNA、Smad2及Smad3表達水平 TGF-β1刺激1 h、24 h后，離心收集細胞，檢測α-SMA、PCNA、Smad2及Smad3表達水平。PBS反復洗滌，根據(jù)蛋白提取試劑盒提取總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒對處理好的CFs行蛋白定量，上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜，1%BSA封閉，加一抗稀釋液(1∶1 000)，洗膜后加二抗稀釋液(1∶5 000)，對所得樣本行免疫蛋白印記分析，通過ECL化學發(fā)光試劑盒顯像，并分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參標準，分別計算α-SMA、PCNA、Smad2及Smad3灰度值與β-actin灰度值的比值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行分析，計數(shù)資料以n，%表示，行χ2檢驗，計量資料用(±s)表示，行獨立t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析3組CFs增殖水平、膠原蛋白及Smads間的差異性及各時間點測量值的時間差異性。

2 結(jié)果

2.1 原代CFs形態(tài)特征 見圖1。顯微鏡觀察組織塊培養(yǎng)的CFs生長情況，3～5天后CFs游出組織塊，呈形態(tài)飽滿的菱形、多角形胞體，均為貼壁生長，胞質(zhì)透明且折光性強。6～10天后細胞排列緊密，且呈相互融合狀態(tài)。傳代培養(yǎng)保留了原代的特點，采用反復差速貼壁方法培養(yǎng)，純度更高。免疫細胞化學法染色后，顯微鏡下可見波形蛋白細胞胞質(zhì)被染成棕黃色，纖維連接蛋白染色呈強陽性，均符合CFs染色特征，純度超過99%。

圖1 各時期CFs形態(tài)（×200）

2.2 各組大鼠CFs增殖水平及CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量結(jié)果比較見表1。與對照組比較，TGF-β1組CFs的CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量均增加(P＜0.05)；與TGF-β1組比較，觀察組CFs的A490、CoL-Ⅲ均明顯降低(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠CFs Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3表達結(jié)果比較 見表2、圖2。與對照組比較，TGF-β1組Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3明顯升高(P＜0.05)；與 TGF-β1組比較，觀察組的 Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3均明顯降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠CFs增殖水平及CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠CFs增殖水平及CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ含量結(jié)果比較(±s)

與對照組比較，①P＜0.05；與TGF-β1組比較，②P＜0.05

組 別對照組T G F-β 1組觀察組A 4 9 0 0.4 1±0.0 3 0.5 3±0.0 3①0.3 9±0.0 4②C o L-Ⅰ(n g/m L)2.5 7±0.0 5 3.8 6±0.0 2①3.6 2±0.0 5 C o L-Ⅲ(n g/m L)2.9 5±0.0 3 3.8 1±0.0 2①3.1 2±0.0 4②

表2 各組大鼠CFs Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3表達結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠CFs Smad2 mRNA、PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3表達結(jié)果(±s)

與對照組比較，①P＜0.05；與TGF-β1組比較，②P＜0.05

組 別對照組T G F-β 1組觀察組S m a d 2 m R N A 3.2 6±0.0 2 5.5 7±0.0 3①3.5 2±0.0 4②P C N A(灰度值)0.3 1±0.0 2 0.7 6±0.0 4①0.4 3±0.0 3②α-S M A(灰度值)0.4 2±0.0 4 0.8 4±0.0 3①0.5 3±0.0 2②S m a d 2(灰度值)0.4 5±0.0 2 1.0 2±0.0 3①0.5 8±0.0 4②S m a d 3(灰度值)0.5 1±0.0 3 0.9 7±0.0 4①0.7 6±0.0 5②

圖2 各組大鼠CFs PCNA、α-SMA、Smad2和Smad3蛋白印跡結(jié)果比較

3 討論

心肌纖維化的形成原因與膠原比例失衡有關(guān)，其病理基礎(chǔ)則是由CFs的增殖分化過度引起的[9～10]。TGF-β1是目前治療器官纖維化的重要靶標，是調(diào)控細胞增殖分化的重要因子，促進細胞外機制沉淀積聚，誘導CFs的增殖分化，刺激膠原蛋白的高表達，進而導致細胞外基質(zhì)降解與合成失衡，最終引發(fā)心肌纖維[11]。相關(guān)研究表明，Smad蛋白為TGF-β信號通路中的主要分子，Smad信號能夠介導膠原蛋白的合成，且TGF-β1發(fā)揮其生物學作用也是通過Smads信號通路完成的[12～13]。

本研究結(jié)果顯示，CFs經(jīng)過TGF-β1的誘導處理后，TGF-β1組的CFs的A490值明顯較對照組高，但觀察組OM預處理后的A490值則明顯低于TGF-β1組。提示TGF-β1能夠誘導CFs增殖，但OM能夠有效抑制CFs的增殖。研究表明，OM有較強的抗皮膚、肝纖維化的作用，能夠抑制肝星狀細胞中TGF-β1的表達[14]。原因可能是OM為中藥苦參的有效成分，是四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)生物堿，具有抗心律失常、抑制膠原活動度及抗纖維化等作用。

PCNA為DNA合成和復制的輔助因子，是反應(yīng)細胞增殖情況的標志分子之一，PCNA的增加能表明細胞增殖活躍，可參與肺纖維化的進展[15]。α-SMA是肌細胞的標志物，可以作為成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的標志物，α-SMA的高表達狀態(tài)提示膠原蛋白的合成增加[16]。肌細胞外間質(zhì)主要成分是CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ，當心肌纖維化發(fā)展時，膠原蛋白表達上調(diào)，細胞外基質(zhì)沉積，導致心臟功能受損。研究證實，TGF-β1能夠明顯誘導CFs增殖，并促進膠原蛋白的合成[17]。本研究結(jié)果表明，TGF-β1組CFs的PCNA、α-SMA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ均明顯高于對照組。證實TGF-β1能夠誘導CFs大量增殖，且在TGF-β1刺激下，大量成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，而經(jīng)過轉(zhuǎn)變的成纖維細胞則會合成和分泌大量膠原，引起細胞外基質(zhì)沉積，促進心肌纖維化的進展。而觀察組的PCNA、α-SMA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ均明顯低于TGF-β1組，提示OM能夠改善膠原及細胞外基質(zhì)大量堆積的情況，阻止纖維化進展。

趙娜等[18]研究發(fā)現(xiàn)苦參素能夠抑制TGF-β/Smads信號通路，有效改善糖尿病心肌病大鼠的心肌纖維化發(fā)展。國外研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化與TGF-β1誘導的Smads的磷酸化以及磷酸化的Smads核移位有關(guān)[19]。本研究結(jié)果也顯示，TGF-β1組CFs Smad2基因、Smad2、Smad3蛋白表達明顯高于對照組，而觀察組上述指標的表達則明顯低于TGF-β1組。提示心肌纖維化的發(fā)展與Smad2、Smad3密切相關(guān)。且可以從中發(fā)現(xiàn)OM能夠有效抑制TGF-β1的表達，從而降低Smad2、Smad3蛋白表達水平，起到阻斷TGF-β/Smads信號通路，減少細胞外基質(zhì)的堆積，降低膠原蛋白的大量分泌，抗纖維化的作用。

綜上，OM能夠明顯抑制TGF-β1誘導的CFs增殖與分化，主要作用機制可能與降低心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的Smad2、Smad3蛋白表達，進而阻斷TGF-β/Smads信號系統(tǒng)有關(guān)。具體作用機制還需進一步的臨床研究。