李競

寧波市鄞州人民醫(yī)院，浙江 寧波 315100

隨著生活水平的不斷提高，越來越多的人遭受著肥胖帶來的困擾。肥胖人群不僅會飽受各種各樣的代謝性疾病的煎熬，而且患心腦血管類疾病的風(fēng)險(xiǎn)還會大大增加[1]。近年來，中藥姜黃的降血脂作用逐步為臨床所認(rèn)可，其主要提取物白藜蘆醇具有抗氧化[2]、抗炎癥[3]、抗腫瘤[4]、保護(hù)心血管[5]以及延緩衰老[6]的作用。研究發(fā)現(xiàn)姜黃具有抗肥胖作用[7]，其提取物白藜蘆醇一方面可以增加棕色脂肪組織的產(chǎn)熱，另一方面還能抑制脂肪生成相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)。然而由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系，提取物白藜蘆醇進(jìn)入人體后只會大量聚集在人體的腸道，而不能被腸道吸收，所以只有很少量的白藜蘆醇能夠被內(nèi)臟脂肪部位所吸收，通過上述機(jī)理發(fā)揮抗肥胖作用十分有限[8]。因此，本研究團(tuán)隊(duì)提出了一個(gè)假設(shè)，姜黃更有可能是通過腸道菌群介導(dǎo)來調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪代謝從而產(chǎn)生抗肥胖作用。腸道菌群，人體后天獲得的第二個(gè)“基因組”，可以促進(jìn)人體營養(yǎng)的吸收，抑制病原菌的侵入，維持正常的黏膜免疫功能，以及調(diào)節(jié)脂肪代謝[9]。研究證明無菌小鼠接種多形擬桿菌后，其吸收和儲存能量的能力得到了一定的提升[10]。此外，腸上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生一種低密度脂蛋白抑制因子—禁食誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞因子(fasting induced adipose factor，F(xiàn)IAF)。腸道菌群能夠調(diào)控FIAF的表達(dá)，F(xiàn)IAF水平的變化會引起受體輔助激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator 1，PGC-1α)和腺苷一磷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphate-activated protein，AMP)活性的變化，從而對甘油三酯的代謝產(chǎn)生影響[11]。本研究采用高脂日糧飼養(yǎng)建立高脂小鼠模型，以姜黃進(jìn)行干預(yù)，從腸道菌群的角度出發(fā)，闡述姜黃、腸道菌群以及脂肪代謝三者之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8周齡的健康雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量(25±2)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK(京)2016-0009。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在寧波市鄞州人民醫(yī)院動(dòng)物房內(nèi)進(jìn)行，小鼠飼養(yǎng)在室溫18～22℃，相對濕度50%～60%，自由攝食和飲水，每天給予充足的飲水和相應(yīng)試驗(yàn)方案的飼料，單籠飼養(yǎng)，12 h光照和12 h黑暗交替。

1.2 材料、試劑和儀器 姜黃藥材購于鄞州人民醫(yī)院，經(jīng)鑒定為姜黃的干燥塊莖；按中藥煎制方法，制成濃度相當(dāng)于1 g/mL生藥的姜黃湯劑。Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購于賽默飛世爾公司，熒光素Cy3購于Sigma公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 分組、干預(yù)及標(biāo)本的采集 按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為正常組、模型組以及姜黃組3組，每組10只。正常組用正常飼料飼養(yǎng)(總卡路里3.25 kcal/g，脂肪中卡路里占比10%)，模型組和姜黃組均用高脂肪的飼料飼養(yǎng)(總卡路里3.68 kcal/g，脂肪中卡路里占比50%)，姜黃組小鼠灌胃姜黃(200 mg/kg)，灌胃體積為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)12周，其他2組灌胃等量的生理鹽水。末次給藥后，小鼠禁食6 h后通過頸椎脫臼法處死，分離其腸、肝臟及內(nèi)臟脂肪組織，保存在液氮中，用于后續(xù)的研究分析。

1.4 生化分析 小鼠禁食6 h后，抽取血樣，3 000 r/min、4℃條件下離心10 min。采用酶比色法測定總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的濃度。

1.5 熒光原位雜交法檢測腸道主要菌群 ①固定：結(jié)腸內(nèi)容物與磷酸鹽緩沖液以1∶9的比例混合并渦旋3 min，吸取0.2 mL的懸浮液加入至3%的福爾馬林中儲存進(jìn)行固定，4℃過夜。②探針：擬桿菌特異性探針(Bac303，5'-CCAATGTGGG GGACCTT-3')，乳酸菌特異性探針(Lab158，5'-GGTATTAGCA CTGTTTCCA-3')，雙歧桿菌特異性探針(Bif164，5'-CATCCGGC ATTACCACCC-3')，糞腸球菌特異性探針(Enf191，5'-GAAAGC GCCTTTCACTCTTATGC-3')，以及細(xì)菌通用探針(EUB388，5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3')。采用上述探針對腸道主要菌群進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)菌通用探針用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記，其他探針均用熒光素Cy3標(biāo)記。③雜交反應(yīng)：取20μL探針、10μL親和素量子點(diǎn)與50μL雜交緩沖液(55 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，甲酰胺 40%，0.01%SDS)混合，最終探針濃度為4ng/μL。④溫育及檢測：雜交后，吸取150μL雜交溶液，離心15 min，然后再加入清洗緩沖液(55 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5 mmol/L EDTA，0.01%SDS)溫育30 min，吸取200μL加入到500μL的PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測分析 總RNA采用Trizol試劑盒分別從小腸和肝組織中提取，隨后用脫氧核糖核苷酸酶處理。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，用qPCR試劑盒對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。每5μLcDNA反應(yīng)液與1 ng總RNA和900 nM基因特異性引物按照以下參數(shù)進(jìn)行PCR檢測，95℃5 min循環(huán)1次，95℃20 s循環(huán)45次，60℃30 s循環(huán)45次，72℃20 s循環(huán)45次，72℃5 min循環(huán)1次。FIAF引物序列：上游5'-CTCTGGGATCTCCACCATTT-3'，下游 5'-TTGGGGATCTCC GAAGCCAT-3'；脂蛋白酯酶(LPL)引物序列：上游5'-TACCGC AGCTAGGAATAATGG-3'，下游 5'-CGGAACTACGACGGTAT-3’；內(nèi)參β-Actin引物序列：上游5'-CATCCTGCGTCTGGA CCTGG-3'，下游 5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)引物序列：上游5'-CCTGAAGTTC ATCTGCACCA-3'， 下 游 5'-TCAGCCACTCTTGCAGCTTT-3’；膽固醇7α-羥化酶(Cyp7α1)引物序列：上游5'-AGTTACTC TTCCCGTTTC-3'，下游 5'-ATCACCTCCAGCCTCTAC-3'。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的比值計(jì)算各基因的相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以(±s)表示，兩組之間的比較采用單因素方差分析，隨后采用Tukey's檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量比較 見表1。與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、肝臟脂肪及腹部脂肪明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，姜黃組小鼠體質(zhì)量、肝臟脂肪及腹部脂肪明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量比較(±s) g

表1 各組小鼠體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量比較(±s) g

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組姜黃組n 1 0 1 0 1 0體質(zhì)量2 8.4±2.4 1 4 9.5±5.1 2①3 0.1±3.1 4②肝臟脂肪5.1 1±0.6 2 6.6 5±0.7 2①5.6 2±0.5 9②腹部脂肪3.9 8±0.4 1 7.1 6±0.8 6①4.0 2±0.4 1②

2.2 各組小鼠血脂水平比較 見表2。與正常組比較，模型組小鼠血清TC、LDL-C水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而血清TG水平?jīng)]有明顯變化。與模型組比較，姜黃組小鼠血清TC、LDL-C水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組小鼠血脂水平比較(±s) mmol/L

表2 各組小鼠血脂水平比較(±s) mmol/L

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組姜黃組n 1 0 1 0 1 0 T C 1.6 2±0.0 9 2.2 8±0.1 2①1.7 7±0.0 5②T G 1.2 5±0.0 8 1.3 2±0.0 9 1.1 7±0.0 1 H D L-C 1.8 7±0.1 2 0.9 2±0.0 5①1.9 2±0.0 6②L D L-C 1.4 2±0.0 2 3.0 2±0.1 4①1.7 5±0.0 7②

2.3 各組小鼠腸道菌群構(gòu)成比較 見表3。與正常組比較，模型組小鼠腸道菌群中乳酸菌、雙歧桿菌顯著降低，糞腸球菌顯著升高，擬桿菌/厚壁菌的比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，姜黃組小鼠腸道菌群中乳酸菌、雙歧桿菌顯著升高，糞腸球菌顯著降低，擬桿菌/厚壁菌的比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組小鼠腸道菌群構(gòu)成比較

2.4 各組小鼠小腸FIAF mRNA和LPL mRNA表達(dá)水平比較見表4。與正常組比較，模型組小鼠小腸FIAF mRNA的表達(dá)水平降低，LPL mRNA的表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，姜黃組小鼠小腸FIAFmRNA的表達(dá)水平升高，LPL mRNA的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 各組小鼠小腸FIAFmRNA和LPLmRNA表達(dá)水平比較(±s)

表4 各組小鼠小腸FIAFmRNA和LPLmRNA表達(dá)水平比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組姜黃組n 1 0 1 0 1 0 F I A F m R N A 1.0 0±0.0 2 0.2 6±0.0 3①0.8 7±0.0 6②L P L m R N A 1.0 1±0.0 1 2.3 0±0.3 1①1.2 3±0.1 5②

2.5 各組小鼠肝臟脂肪生成相關(guān)因子水平比較 見表5。與正常組比較，模型組小鼠肝臟LPLmRNA和SCD1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Cyp7α1 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，姜黃組小鼠肝臟LPL mRNA和SCD1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，Cyp7α1 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表5 各組小鼠肝臟脂肪生成相關(guān)因子水平比較(±s)

表5 各組小鼠肝臟脂肪生成相關(guān)因子水平比較(±s)

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組姜黃組n 1 0 1 0 1 0 L P L m R N A 1.0 0±0.0 1 4.0 1±0.5 1①1.5 2±0.2 0②C y p 7 α 1 m R N A 1.0 0±0.0 1 0.3 2±0.0 3①2.1 2±0.2 4②S C D 1 m R N A 1.0 1±0.0 1 2.0 6±0.1 5①1.1 1±0.0 7②

3 討論

眾所周知，造成肥胖的因素即來自機(jī)體內(nèi)部基因，也來自外界環(huán)境，通常內(nèi)外因素共同所致[12]。本研究采用日常高脂肪的飲食構(gòu)建小鼠內(nèi)臟型肥胖模型。腸道菌群作為內(nèi)環(huán)境因素的一種，能夠加速機(jī)體內(nèi)多糖的代謝和誘導(dǎo)機(jī)體脂肪的重新生成，最終起到改善體內(nèi)脂肪儲蓄的作用。小鼠日常的高脂肪飲食會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃的攝入會明顯改善小鼠的腸道菌群失調(diào)。腸道菌群構(gòu)成的變化與機(jī)體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。擬桿菌屬和厚壁菌屬是影響機(jī)體能量代謝的主要菌屬。研究表明肥胖型小鼠腸道中厚壁菌的數(shù)量偏高，而擬桿菌的數(shù)量則偏低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸道中擬桿菌/厚壁菌占比要低于正常組小鼠，此外姜黃可以改變腸道菌群構(gòu)成，能夠促使擬桿菌/厚壁菌比例達(dá)到平衡。上述研究結(jié)果表明姜黃具有一定的益生菌作用，對機(jī)體的脂質(zhì)代謝產(chǎn)生積極的影響。

研究表明，多酚類物質(zhì)可以與特定細(xì)菌的細(xì)胞膜相連接從而發(fā)揮一定的抑菌作用[15]。而不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也會導(dǎo)致抑菌作用有所不同，比如革蘭氏陽性菌對多酚類物質(zhì)要比革蘭氏陰性菌更加敏感。一方面課題組在研究中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能明顯抑制糞腸球菌的生長，另一方面，姜黃提取物白藜蘆醇能夠促進(jìn)乳酸菌、雙歧桿菌以及擬桿菌的生長。多酚類物質(zhì)的抑菌作用機(jī)制并不能很好地解釋本研究的結(jié)果，為此，需要闡明姜黃影響腸道菌群的其它作用機(jī)制。

FIAF在在腸上皮、脂肪、肝臟中均有表達(dá)，LPL是脂質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、清除和代謝的關(guān)鍵酶，而FIAF是LPL的抑制劑；同時(shí)腸道微生物可以抑制FIAF在腸道上皮細(xì)胞的表達(dá)，減弱FIAF對LPL的活性的抑制[16]。本研究顯示，模型組小鼠腸道中FIAFmRNA的表達(dá)水平低于姜黃組，LPL mRNA的表達(dá)水平高于姜黃組，表明姜黃可以提升小鼠腸道脂肪細(xì)胞中FIAFmRNA的表達(dá)，抑制腸道與肝臟中LPL mRNA的表達(dá)，從而控制脂滴的積聚而抑制脂肪的合成，改善機(jī)體的脂質(zhì)代謝。Cyp7α1和SCD1在不飽和脂肪酸的合成和調(diào)節(jié)方面起著重要的作用[17]。Cyp7α1用于催化膽固醇的分解代謝，而敲除SCD1基因的小鼠體內(nèi)的脂肪合成減少、體質(zhì)量減輕、肝臟脂質(zhì)沉積量降低[18]。在肝臟組織中，姜黃能夠提升Cyp7α1的表達(dá)水平以及降低SCD1的表達(dá)水平，這說明姜黃能夠通過控制脂肪酸和膽固醇分解代謝通路來改善機(jī)體能量代謝。本研究中姜黃能夠抑制脂肪細(xì)胞中Cyp7α1 mRNA和SCD1 mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步抑制脂肪的合成，改善機(jī)體的脂質(zhì)代謝。

綜上所述，姜黃通過腸道菌群能夠引起機(jī)體脂肪的重新生成，作用機(jī)制可能為通過提升小腸FIAF mRNA和Cyp7α1 mRNA的表達(dá)水平，抑制小腸和肝臟組織中LPL mRNA和SCD1 mRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。