王 鵬，王文平*，續(xù)丹丹，張 欣，馬翛然，張 建，高麗華，崔金梅，鄭晨曦

（1.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；2.北京市食品釀造研究所，北京 100050；3.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

醬油起源于中國，有超過2 000年的歷史[1]。醬油是以大豆、豆粕、小麥、麩皮、水、鹽等作為原料，通過米曲霉制曲發(fā)酵，后期添加鹽水自然發(fā)酵或乳酸菌和酵母菌厭氧發(fā)酵制得[2-3]。在多種微生物的共同作用下，醬油產(chǎn)生了獨特的風(fēng)味和滋味物質(zhì)，如酯類、醇類、醛酮類、游離氨基酸、多肽以及美拉德產(chǎn)物等。它以獨特的風(fēng)味和咸鮮味在亞洲國家盛行，是人們?nèi)粘ｏ嬍持斜貍涞恼{(diào)味品。

我國醬油以工藝劃分可以分為高鹽稀態(tài)發(fā)酵、低鹽固態(tài)發(fā)酵和原池澆淋發(fā)酵，目前我國醬油企業(yè)的工藝多以前兩種發(fā)酵工藝為主。高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝具有發(fā)酵時間長，醬醅鹽分含量高（18%～20%），水分比例大（鹽水∶原料=2.0～2.5）等特點，這種工藝生產(chǎn)的醬油通常由于耐鹽微生物及較長的發(fā)酵周期，其原料發(fā)酵更徹底，產(chǎn)生的醬油色澤較淺，風(fēng)味物質(zhì)更豐富，通常具有較好的風(fēng)味[4-5]；低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝發(fā)酵時間短，醬醅含鹽量低（6%～7%），水分含量低（鹽水∶原料=1∶1），生產(chǎn)效率高，成本低，產(chǎn)出的醬油色澤較深且酯香味不足[6]；原池澆淋技術(shù)是在低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，含鹽量通常為14%左右，醬醅含水量在57%左右，采用先固后稀工藝，通過回流方式對發(fā)酵底物澆淋，充分利用酶活以提高原料的利用率和氨基酸的生產(chǎn)率，其發(fā)酵周期較短，產(chǎn)出的醬油色澤光亮，通過在發(fā)酵前期或者中期加入酵母菌和乳酸菌，能明顯改善產(chǎn)品風(fēng)味質(zhì)量[7-8]。

黑豆?fàn)I養(yǎng)價值豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá)40 g/100 g，富含鈣、硒、鋅、鎂、磷等多種微量元素及維生素[9]，其表皮中富含的原花青素（3.61%～5.59%）被認(rèn)為是目前研究發(fā)現(xiàn)的一種高效的自由基清除劑，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、降血糖、抗腫瘤等作用[10-11]。金衛(wèi)東等[12]采用低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)黑豆醬油，并對其理化、氨基酸、脂肪酸等指標(biāo)進(jìn)行分析，得出其含量明顯高于普通醬油。潘麗梅等[13]對黑豆醬油制曲過程的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最優(yōu)的制曲工藝。張歡歡等[14]對黑豆、黃豆兩種蛋白原料制備的高鹽稀態(tài)醬油的理化、抗氧化、風(fēng)味組成等指標(biāo)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)黑豆醬油抗氧化活性高于黃豆醬油，黃豆醬油醇香突出，黑豆醬油中醇、酯及醛酮類主要揮發(fā)性成分較均衡，風(fēng)味協(xié)調(diào)。

本研究以黑豆為原料，采用原池澆淋發(fā)酵工藝制備黑豆醬油，分析其產(chǎn)品感官、理化及微生物指標(biāo)，并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和全自動氨基酸分析儀分析了醬油中的香氣物質(zhì)組成和氨基酸組成，為黑豆的深度開發(fā)和黑豆醬油的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定的實驗基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

某品牌黃豆醬油（特級醬油）、黑豆、面粉、食鹽：北京某市場；米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951（滬釀3.042）和生香酵母FA-1：北京市食品釀造研究所提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

3-辛醇、原花青素、大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素、果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖（純度均≥99%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉、甲醛、正丁醇、硫酸鐵銨乙酸、酚酞、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純），甲醇、乙腈（均為色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5975-7890A氣相色譜質(zhì)譜儀（配安捷倫GC多模式自動進(jìn)樣器）、LC1260液相色譜儀：美國安捷倫公司；65 μm PDMS/DVB萃取頭：美國Supelco有限公司；L-8900氨基酸自動分析儀：日本日立公司；DHG-9051A電熱恒溫干燥箱、DHP-9051B微生物培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；福斯KJELTEC 2300凱氏定氮儀：美國FOSS公司；722型數(shù)顯可見分光光度計：上海光學(xué)儀器五廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆醬油加工工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）原料處理：精選豆粒飽滿、碩大的黑豆，去除雜質(zhì)。將黑豆加入清水中，黑豆與清水質(zhì)量比為1∶3，浸泡6 h后，撈出淋干。將控好水的黑豆放入蒸鍋中，壓力0.1 MPa條件下蒸料40 min；面粉炒制15 min。將蒸煮好的黑豆放入冷卻槽中冷卻降溫，溫度降至60℃時，與炒制面粉混合均勻，繼續(xù)自然冷卻。

（2）制曲：當(dāng)物料冷卻至33℃時，按接種量0.03%接種米曲霉AS3.951并混合均勻，入制曲盤，溫度控制在32～34℃，14～16h翻曲一次，培養(yǎng)42h出曲。所制得的曲料呈黃綠色，表面有孢子，中性蛋白酶活力為800～1 000 U/g。

（3）酵母醪制備：將小麥用對輥式粉碎機破碎至3～4瓣，加溫水潤料1 h，0.1 MPa條件下蒸煮30 min，出鍋冷卻至31℃。接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的AS3.951米曲霉，制小麥曲培養(yǎng)26～28 h。出曲拌15°Bé的鹽水，鹽水與大曲的質(zhì)量比為2∶1。48℃培養(yǎng)5 d，待麥醪溫度降至38～40℃時添加生香酵母FA-1培養(yǎng)液（106個/mL）培養(yǎng)3 d，即得酵母醪。

（4）發(fā)酵：每個46℃發(fā)酵罐中加入10 kg曲料，50℃的14 °Bé鹽水，鹽水和曲料的質(zhì)量比為0.72∶1，進(jìn)行發(fā)酵，每天澆淋一次，發(fā)酵8 d，得前酵產(chǎn)物。向發(fā)酵罐中前酵產(chǎn)物補加45℃的18°Bé鹽水15 kg，每天澆淋一次。發(fā)酵10 d后，加入500 mL酵母醪，發(fā)酵溫度改為42℃，發(fā)酵40 d左右，即得黑豆醬油。

1.3.3 分析檢測

黑豆醬油感官指標(biāo)及理化指標(biāo)（氨基酸態(tài)氮、全氮、可溶性無鹽固形物）按照國標(biāo)GB 18186—2000《釀造醬油》中的方法測定；微生物指標(biāo)根據(jù)國標(biāo)GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》中的方法測定。

按照國標(biāo)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》測定游離氨基酸含量；大豆異黃酮含量測定參照GB/T 26625—2011《大豆異黃酮含量測定》中的高效液相色譜法；原花青素含量測定參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中的方法；還原糖含量測定參照國標(biāo)GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》。

1.3.4 黑豆醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

樣品前處理：稱取2.0g黑豆醬油樣品于20mL萃取瓶中，加入0.5g氯化鈉調(diào)節(jié)離子強度，吸取內(nèi)標(biāo)物100μg/mL 3-辛醇溶液10 μL。在50℃條件下振蕩40 min，然后萃取40 min。萃取后于氣相色譜儀進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，采用不分流模式進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250℃。程序升溫程序：40℃保持3 min，以5℃/min的速度升至100℃，然后以6℃/min的速度升至220℃并保持10 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，掃描模式為全掃描，掃描范圍35～400 amu。

定性定量方法：化合物組成的分析以美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）08譜庫檢索結(jié)果進(jìn)行確定，保留匹配度＞750的組分；采用內(nèi)標(biāo)法（質(zhì)量濃度100 μg/mL 3-辛醇溶液10 μL）計算各組分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆醬油的感官指標(biāo)

表1 兩種醬油感官指標(biāo)結(jié)果Table 1 Results of sensory indexes of two kinds of soy sauce

由表1可知，與某品牌黃豆醬油比較，黑豆醬油色澤更厚重，呈黑褐色，醬香濃郁，味道鮮美，狀態(tài)澄清、無懸浮物和雜質(zhì)。結(jié)果表明，黑豆醬油的感官指標(biāo)達(dá)到相關(guān)國標(biāo)特級醬油標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 黑豆醬油的理化指標(biāo)

表2 兩種醬油理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Results of physiochemical indexes of two kinds of soy sauce

由表2可知，黑豆醬油中可溶性無鹽固形物、全氮、氨基酸態(tài)氮含量分別為16.62 g/100 mL、1.53 g/100 mL、0.85 g/100 mL，均高于某品牌黃豆醬油，并且達(dá)到特級醬油國標(biāo)要求。

大豆異黃酮是豆制品中一種天然植物雌激素，具有預(yù)防心血管疾病、骨質(zhì)疏松及更年期綜合征等多種生物活性作用[15]。兩種醬油中大豆異黃酮含量分別為6.82 mg/100 g和6.62 mg/100 g，兩者相差不大，其中染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素含量在1.16～2.08 mg/100 g范圍。黑豆醬油中果糖（0.5%），黃豆醬油中葡萄糖（1.0%）。原花青素具有很強的抗氧化活性，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、降血糖、延緩皮膚衰老等作用[16]。黑豆醬油中原花青素含量為24.2 mg/100 g，這賦予了黑豆醬油一定的保健功效。

2.3 黑豆醬油的微生物指標(biāo)

表3 兩種醬油微生物指標(biāo)結(jié)果Table 3 Results of microbial indexes of two kinds of soy sauce

由表3可知，兩種醬油中菌落總數(shù)均＜10 CFU/mL，大腸菌群＜30 MPN/100 mL，致病菌沙門氏菌均未檢出，金黃色葡萄球菌檢驗結(jié)果為＜10 CFU/mL，結(jié)果表明，黑豆醬油微生物指標(biāo)滿足相關(guān)國標(biāo)要求。

2.4 醬油的風(fēng)味成分分析

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對兩種醬油中的香氣成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。由表4可知，兩種醬油共有92種風(fēng)味化合物檢出，黑豆醬油和黃豆醬油中鑒定出的風(fēng)味化合物分別為75和77種，其中黑豆醬油中的風(fēng)味組成包括吡嗪類（8種）、醇類（8種）、酚類（5種）、含硫化合物（7種）、醛類（10種）、酸類（7種）、酮類（6種）、酯類（17種）、其他類（7種）。兩種醬油中醇類化合物含量最高，醛類、酸類及酯類次之，這些化合物為醬油獨特的風(fēng)味貢獻(xiàn)了極其重要的作用。

醇類物質(zhì)在醬油風(fēng)味化合物中含量最高，兩種醬油中均鑒定出8種醇類化合物，黑豆醬油中總含量為740.54μg/kg，以乙醇和苯乙醇為主，這與張艷芳等[17]的研究結(jié)果類似。醇類通常具有令人愉快的甜香味，主要是在發(fā)酵過程中由微生物代謝，不飽和脂肪酸降解以及羰基化合物的還原反應(yīng)生成的[18]。黑豆醬油中苯乙醇含量為334.76 μg/kg，遠(yuǎn)高于黃豆醬油中其含量（64.89 μg/kg）。苯乙醇具有玫瑰花香味，是醬油中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物[19]，是醬醪在發(fā)酵過程中由苯丙氨酸降解產(chǎn)生的[20-21]。

表4 兩種醬油中揮發(fā)性化合物GC-MS分析結(jié)果Table 4 Results of volatile compounds in two kinds of soy sauce analysis by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

酸類化合物在醬油中的主要貢獻(xiàn)是對醬油香氣具有一定的緩和作用[22]，并在發(fā)酵過程中與醇類發(fā)生酯化反應(yīng)。酸類可能是由微生物產(chǎn)生的脂肪酶對大豆油脂降解所產(chǎn)生，低分子質(zhì)量脂肪酸也可能通過酵母或乳酸菌代謝生成[23]。黑豆醬油中共檢出7種酸，總含量達(dá)到148.46 μg/kg，其中2-甲基丁酸、3-甲基丁酸及乙酸的含量分別為66.74μg/kg、50.68 μg/kg和12.85 μg/kg。

黑豆醬油和黃豆醬油中含硫化合物含量分別為108.84μg/kg和64.89μg/kg，對醬油的風(fēng)味起著重要的作用，它們多存在于釀造產(chǎn)品中，是由含硫蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生[24]。黑豆醬油中3-甲硫代丙醇含量很高，為36.76 μg/kg，占含硫化合物總含量的30%左右，其在較低濃度時呈現(xiàn)較為強烈的烤肉香氣[25]。

兩種醬油中的酯類化合物種類最多，黑豆醬油中共鑒定出17種酯類化合物，總含量為121.01 μg/kg。醬油中的酯類化合物主要以短鏈乙酯為主[25]，通常具有較強的揮發(fā)性，具有更小的香氣閾值且多呈果香味[26]，如乙酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、丁二酸二乙酯等，它們主要是通過酵母菌對大豆油脂作用產(chǎn)生醇類和酸類酯化反應(yīng)得到[27]，其中乙酸乙酯含量最高，為24.27 μg/kg；苯乙酸乙酯其次，為18.92 μg/kg，具有濃烈而甜的蜂蜜香氣[28]。長鏈脂肪酸酯中含量較高的是十六烷酸乙酯，含量為8.21 μg/kg。

黑豆醬油中醛類化合物含量僅次于醇類，為224.48μg/kg，共鑒定出11種，以2-甲基丁醛（44.61 μg/kg）和苯乙醛（39.61 μg/kg）為主。低分子質(zhì)量醛主要是由氨基酸降解和微生物轉(zhuǎn)化形成的，如2-甲基丁醛、苯乙醛、可卡醛、3-甲基丁醛以及苯甲醛等[29]。吡嗪類化合物也是醬油風(fēng)味的重要組成部分，主要是通過蛋白質(zhì)以及氨基酸的熱分解或美拉德反應(yīng)形成。2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪以及四甲基吡嗪都能為醬油提供烤可可和堅果的香氣[25]。黑豆醬油中檢出8種吡嗪類化合物，總含量為98.14 μg/kg，其中4-甲基吡嗪含量最高，達(dá)到39.26 μg/kg。

黑豆醬油中酚類物質(zhì)含量為137.04 μg/kg，且有5種酚類被檢出，其中4-乙基愈創(chuàng)木酚在兩種醬油中均被檢出，酚類主要是在發(fā)酵過程中通過曲霉的降解作用產(chǎn)生。

2.5 醬油的游離氨基酸組成

對兩種醬油中游離氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 兩種醬油樣品中游離氨基酸檢測結(jié)果Table 5 Determination results of free amino acids in two kinds of soy sauce

由表5可知，黑豆醬油和黃豆醬油中均分別檢出17種游離氨基酸（含7種必需氨基酸），對醬油滋味影響較大[30]。黑豆醬油游離氨基酸總量為37 749.61 μg/mL（其中必需氨基酸含量為16793.43μg/mL），而黃豆醬油中游離氨基酸總量為43 517.95μg/mL（必需氨基酸含量為19 063.49μg/mL）。黑豆醬油中鮮味氨基酸含量為9 471.03μg/mL，苦味氨基酸含量為17383.25μg/mL，甜味氨基酸含量（10 839.1μg/mL），酸味氨基酸含量（56.23μg/mL）。黑豆醬油因其游離氨基酸含量較高，且含有人體所需的必需氨基酸，因此具有較高的營養(yǎng)保健價值。

3 結(jié)論

利用蛋白質(zhì)含量較高的黑豆為原料，按照原池澆淋發(fā)酵工藝制備黑豆醬油，對其感官、理化、微生物指標(biāo)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，黑豆醬油呈黑褐色、醬香濃郁、味道鮮美，其可溶性無鹽固形物、全氮、氨基酸態(tài)氮含量分別為16.62g/100mL、1.53g/100mL、0.85g/100mL，達(dá)到相關(guān)國標(biāo)特級醬油的要求。黑豆醬油大豆異黃酮含量為6.82mg/100g，原花青素含量為24.2 mg/100 g。黑豆醬油中共鑒定出75種風(fēng)味化合物，以醇類（740.54 μg/kg）、醛類（230.90 μg/kg）、酯類（121.01μg/kg）為主，共檢測出游離氨基酸17種（含7種必需氨基酸），總量為37 749.61 μg/mL（其中必需氨基酸含量為16 793.43 μg/mL）。該工藝制備黑豆醬油生產(chǎn)周期短、風(fēng)味豐滿，具有營養(yǎng)保健功效及良好開發(fā)應(yīng)用前景。