李軍燕，羅宏亮，王 瑞，楊蓮茹，趙治國，張 偉，李 斌，楊曉野*，羅曉平

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,呼和浩特 010031; 3.內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局,內(nèi)蒙古呼和浩特 010020; 4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆烏魯木齊 830052; 5.金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010020)

捕食線蟲性真菌在自然界中廣泛存在，它們大都生長(zhǎng)在腐爛的樹葉、木材、苔蘚、腐殖質(zhì)土壤及動(dòng)物糞便中。近幾十年，國內(nèi)外研究學(xué)者研究最多的捕食性真菌為少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)和Duddingtoniaflagrans，并取得了豐碩的成果[1-3]。

這些捕食性真菌特有的捕食性器官——菌環(huán)、菌網(wǎng)等結(jié)構(gòu)特征明顯，是國內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注最多的一類殺線蟲天敵。它通過產(chǎn)生捕食性器官捕獲并殺死線蟲，進(jìn)而將線蟲消化。其中D.flagrans菌可產(chǎn)生大量的厚壁孢子，在通過動(dòng)物的胃腸道時(shí)不易被消化，能隨糞便一起排出體外[4-6]。條件滿足時(shí)，其孢子萌發(fā)為菌絲，進(jìn)而產(chǎn)生捕食器官，捕獲殺死糞便中發(fā)育的線蟲幼蟲，從而顯著降低環(huán)境中感染性幼蟲的數(shù)量而起到生物防治的作用。

在獸醫(yī)領(lǐng)域中，利用捕食線蟲性真菌作為一種新的防治寄生蟲手段在國外已開展了廣泛的研究，且在農(nóng)作物線蟲的生物防治上已有了商品化的捕食線蟲真菌制劑[7]。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)楊曉野教授帶領(lǐng)的科研團(tuán)隊(duì)在研究少孢節(jié)叢孢菌和D.flagrans生物學(xué)特性和殺蟲作用等方面，取得了許多重要的研究成果[8-9]。但從國內(nèi)外來看，對(duì)捕食線蟲性真菌詳細(xì)的捕食過程和機(jī)制尚不完全清楚，這就要求我們首先應(yīng)對(duì)捕食性真菌捕食器萌發(fā)、產(chǎn)生及捕食線蟲過程的一系列動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行詳盡的了解。因此，本試驗(yàn)對(duì)捕食性真菌在捕食線蟲的過程中產(chǎn)生的細(xì)微變化，如捕食器的形成過程、捕獲蟲體前后的變化等進(jìn)行了詳細(xì)的觀察。以線蟲第3期幼蟲作為誘導(dǎo)物，在玻片培養(yǎng)基中刺激捕食性真菌產(chǎn)生捕食器，然后對(duì)其捕食線蟲過程進(jìn)行了適時(shí)動(dòng)態(tài)的觀察，這為今后深入研究捕食性真菌的捕食機(jī)制提供了基本的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

普通瓊脂粉，北京化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；新鮮玉米粉，購自集貿(mào)市場(chǎng)；馬圓線蟲3期幼蟲，來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物園。

1.2 方法

1.2.1 0.4 g/L玉米粉瓊脂(CMA)玻片培養(yǎng)基制備 稱取40 g新鮮玉米粉，加入1 000 mL去離子水，微火煮沸1 h，補(bǔ)足水分至1 000 mL，用350目紗網(wǎng)過濾，然后取濾液10 mL，加去離子水990 mL，pH調(diào)至6.0～6.2，再加瓊脂粉20 g，經(jīng)121℃ 25 min高壓滅菌。冷卻至室溫后，倒入裝有載玻片的直徑為90 mm培養(yǎng)皿中，液面以剛剛沒過載玻片為宜。待培養(yǎng)基凝固后，用手術(shù)刀沿載玻片邊緣將薄片培養(yǎng)基小心切下，放入新的無菌培養(yǎng)皿中。

1.2.2 供試線蟲培養(yǎng)、收集和滅菌 將采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物園的新鮮馬糞，輕輕碾碎，置于干凈的搪瓷盤中，頂部稍高于搪瓷盤邊緣，其上蓋一塊滅菌紗布，蓋好搪瓷盤蓋，置于28℃恒溫箱中。定時(shí)攪拌疏松糞便，并噴灑適宜蒸餾水保持濕度。培養(yǎng)10 d～14 d后，用滅菌蒸餾水將蓋上的L3沖洗到無菌燒杯中，自然沉淀后棄去上清，放置保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述制備好的馬圓線蟲三期幼蟲(L3)懸浮液計(jì)數(shù)后，調(diào)整每毫升蟲體數(shù)約為4 000 條/mL，每個(gè)EP管中加入1 mL，然后用無菌水4 000 r/min洗滌離心5 min，重復(fù)3次。最后一次離心后棄掉上清，在沉淀物中加入5 mL/L的甲醛，浸泡15 min，然后再用前述方法，進(jìn)行3次無菌水同樣洗滌。最后按青霉素200 U/mL、鏈霉素200 U/mL、卡那霉素100 μg/mL、制霉菌素12.5 μg/mL、兩性霉素B 5.0 μg/mL加入抗生素復(fù)合液，4℃作用過夜。之后，4 000 r/min離心5 min，棄去上清。再用無菌去離子水離心洗滌數(shù)次，盡可能去除殘余的抗生素。

1.2.3 捕食性真菌D.flagrans的捕食過程研究 在超凈工作臺(tái)中，取實(shí)驗(yàn)室已培養(yǎng)好的D.flagrans培養(yǎng)基，在菌絲生長(zhǎng)均勻處用無菌手術(shù)刀切下直徑約為5 mm左右的瓊脂塊，倒置放在玻片培養(yǎng)基的中間，接種3個(gè)培養(yǎng)基，設(shè)置1個(gè)對(duì)照組。最后再放入直徑120 mm的無菌培養(yǎng)皿中(提前鋪有無菌濾紙，外加少許無菌蒸餾水以保持濕度)，后置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)到第3天時(shí)，加入馬圓線蟲三期幼蟲，對(duì)照組不加。于接種后每隔2 h觀察1次，次日起每天觀察1次，連續(xù)觀察數(shù)天，拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 D.flagrans菌環(huán)及菌網(wǎng)形成

經(jīng)對(duì)捕食性真菌D.flagrans捕食線蟲的動(dòng)態(tài)過程觀察后得知，接種有較強(qiáng)活力的線蟲三期幼蟲2 h后，捕食器1菌環(huán)開始萌芽，逐漸生長(zhǎng)呈半環(huán)狀，最后閉合為一個(gè)完整的環(huán)形(圖1)，近似圓形或橢圓形。但開始時(shí)，菌環(huán)數(shù)量產(chǎn)生較少，以后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸增多。從1個(gè)菌環(huán)上左右可長(zhǎng)出2個(gè)粗壯的小分枝(圖2)。這些分枝向不同的方向彎曲生長(zhǎng)，重新閉合于原來的菌環(huán)或菌絲，從而形成多個(gè)菌環(huán)(圖3)。在接種4 h后，多個(gè)菌環(huán)繼續(xù)分枝，再與原菌環(huán)或其他菌環(huán)相接，最后形成菌網(wǎng)(圖4)，組成每個(gè)菌網(wǎng)的菌環(huán)數(shù)目各不相同。

2.2 D.flagrans捕食線蟲動(dòng)態(tài)過程觀察結(jié)果

當(dāng)菌環(huán)和菌網(wǎng)大量形成后，即加入蟲體4 h后，有部分三期幼蟲被捕獲(圖5)，被套捕的部位各不相同，大部分在頭頸部和尾部，有一些則在身體的中部。在鏡下可觀察到線蟲不停的掙扎扭動(dòng)。在被捕獲24 h后，線蟲完全致死。接種5 d后，被捕獲的蟲體體壁開始逐漸皺縮(圖6)，菌絲充滿線蟲體內(nèi)，吸收線蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)(圖7)，直至蟲體被完全消解(圖8)。

圖1 菌環(huán)萌發(fā)過程的顯示(40×10)

圖2 菌環(huán)上生長(zhǎng)出的分枝(40×10)

圖3 多個(gè)菌環(huán)形成菌網(wǎng)過程(40×10)

圖4 形成的大面積菌網(wǎng)(20×10)

圖5 菌環(huán)作用的線蟲部位(前部)(40×10)

圖6 死亡的線蟲體壁皺縮(40×10)

圖7 充滿菌絲的線蟲體(40×10)

圖8 被完全消解的線蟲(40×10)

3 討論

D.flagrans和A.oligospora是目前世界上研究動(dòng)物生防真菌公認(rèn)的最具發(fā)展?jié)摿Φ膬煞N候選菌株[10]，二者在加入活的線蟲三期幼蟲后，均能很快產(chǎn)生菌環(huán)。本研究捕食性真菌D.flagrans在接種2 h后開始陸續(xù)出現(xiàn)菌環(huán)萌芽并慢慢閉合為完整菌環(huán)，4 h后即可大量形成菌環(huán)，菌網(wǎng)隨之很快形成。另據(jù)報(bào)道，少孢節(jié)叢孢菌(A.oligospora)在接種幼蟲5 h后，開始大量形成菌環(huán)，9 h后大量菌環(huán)相互連接成菌網(wǎng)。相比較而言，D.flagrans比A.oligospora產(chǎn)生菌環(huán)和菌網(wǎng)的時(shí)間都比較早，顯示了不同菌種各自的特點(diǎn)。從相關(guān)試驗(yàn)來看，2種菌所產(chǎn)捕食器大小基本相近，捕食器菌絲一般均比普通菌絲粗壯。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，隨著菌環(huán)和菌網(wǎng)的大量產(chǎn)生，蟲體逐漸被捕獲，而且D.flagrans捕獲蟲體的速度要快于少孢節(jié)叢孢菌。表明了捕食性真菌D.flagrans產(chǎn)生和形成捕食器的速度更快，顯示了其更好的捕食線蟲的效率和能力。

觀察中發(fā)現(xiàn)被捕獲的蟲體部位多數(shù)為頭頸部和尾部，且頭頸部比尾部稍多，少數(shù)為身體的中部。這可能與蟲體的運(yùn)動(dòng)方式有關(guān)，線蟲在活動(dòng)的時(shí)候，身體的頭部和尾部活動(dòng)性最強(qiáng)，可能最容易刺激菌絲特化形成捕食器。另外，也可能是由于在蟲體的頭頸部存在某種特異性的識(shí)別位點(diǎn)，這種受體與捕食器相互識(shí)別，導(dǎo)致捕食器與蟲體相互吸引、靠近。當(dāng)線蟲被捕食器菌絲牢牢套住無法擺脫后，漸漸喪失活力直至死亡。線蟲的死亡一方面是由于菌環(huán)的束縛，機(jī)械性致死。另一方面據(jù)資料報(bào)道[11]，捕食器菌絲能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶和凝集素，這些物質(zhì)均具有毒性，參與了捕食性真菌捕獲和致死蟲體的過程。當(dāng)菌絲穿透線蟲體壁，向內(nèi)部生長(zhǎng)，不斷充斥線蟲整個(gè)身體大約4 d～5 d后，蟲體被慢慢消解，只剩軀殼。有資料顯示菌絲在伸入蟲體內(nèi)部可以消化其脂肪，吸收其營養(yǎng)物質(zhì)和水分等。

本試驗(yàn)中馬圓線蟲在接種后4 h開始被捕獲，24 h后即被真菌侵入致死，5 d后才被完全消化，這與徐春蘭等[12]和胡黔林等[13]研究中D.flagrans對(duì)秀麗新桿線蟲和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的捕食結(jié)果不同，其中秀麗新桿線蟲在加入后0.5 h即可被捕獲，4 h菌絲侵入體內(nèi)致死，24 h被完全消化；而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在加入后20 h菌絲侵入蟲體，直到24 h時(shí)蟲體腸管破裂死亡，48 h時(shí)被完全消化，蟲體的種類不同，其結(jié)構(gòu)有差異，真菌對(duì)它們作用的時(shí)間也不盡相同，秀麗新桿線蟲是非寄生性線蟲，蟲體無外鞘膜；而后者是寄生性線蟲，體表多了一層外鞘膜，因此真菌進(jìn)入其體內(nèi)需要更長(zhǎng)時(shí)間。

值得注意的是捕食性真菌在整個(gè)培養(yǎng)和觀察試驗(yàn)過程中極易被污染，因此在捕食性真菌捕食線蟲的動(dòng)態(tài)過程觀察中要盡量做到無菌，以免影響觀察結(jié)果。另外，為了在光學(xué)顯微鏡下更好更清晰的觀察其捕食過程，利用改進(jìn)的玻片培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和觀察，實(shí)際應(yīng)用表明效果比較好，便于進(jìn)行拍照。在培養(yǎng)過程中，需保持玻片培養(yǎng)基適宜的濕度，以防止發(fā)生干裂，以確保捕食過程動(dòng)態(tài)觀察的順利進(jìn)行。

綜上所述，本試驗(yàn)基本了解了捕食性真菌D.flagrans捕食器的形成及捕食線蟲的動(dòng)態(tài)變化過程，與已報(bào)道的捕食性真菌少孢節(jié)叢孢菌在捕食線蟲三期幼蟲時(shí)生物學(xué)特性的比較分析，更加證實(shí)了捕食性真菌D.flagrans在臨床應(yīng)用方面的價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Α檫M(jìn)一步闡明捕食性真菌捕食機(jī)理提供了重要的科學(xué)參考依據(jù)。