李叔洪，姜曉文，辛 秀，于文會(huì)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[1]。創(chuàng)面愈合過(guò)程中，遷移增生的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)起到重要作用，它可以為細(xì)胞提供移動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)和向?qū)?，把?xì)胞黏附在一起，對(duì)組織的愈合起到骨架作用，并且影響各種生長(zhǎng)因子生物活性及其調(diào)節(jié)作用[2]。Ⅰ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，主要起到支架的作用，與皮膚的張力大小有關(guān)，Ⅲ型膠原則決定膠原纖維的直徑的大小和彈性的好壞[3]。Ⅲ型膠原含量越高、越細(xì)，彈性越好，形成的瘢痕越輕，所以提高Ⅲ型膠原的比例，對(duì)于創(chuàng)傷愈合質(zhì)量是很重要的[4]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一個(gè)需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作輔助因子的大家族，目前MMPs家族已分離鑒別出20多個(gè)的成員，分別為MMP1-20等[5]，其主要生理作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)。在創(chuàng)傷愈合的早期，MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原肽段，并產(chǎn)生趨化因子，加速炎性細(xì)胞的吞噬作用，對(duì)于炎性反應(yīng)區(qū)的清潔有著重要的作用[6]。其中，MMP-1和膠原有密切的相關(guān)性[7]，可以分解創(chuàng)面膠原，減少創(chuàng)面膠原的大量表達(dá)聚集，使膠原的合成和分解處于平衡狀態(tài)，特別是對(duì)創(chuàng)面Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解起關(guān)鍵作用，在創(chuàng)面愈合中組織重塑階段起到極其重要的作用。MMP-2在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用，在創(chuàng)傷愈合早期瘢痕組織、肉芽組織形成中發(fā)揮作用。MMP-9也稱為明膠酶B，它可參與創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程的幾個(gè)早期步驟，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，對(duì)Ⅰ型前膠原的合成物有明顯的影響，在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合中主要起到延長(zhǎng)組織重塑的作用[8]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是MMPs的內(nèi)源性特異性抑制因子,有4種類型，分別為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。其中，TIMP-1可以特異性地與MMP-1和MMP-9結(jié)合從而抑制其表達(dá)[9]，TIMP-2是MMP-2的特異性抑制劑，可以有效的抑制MMP-2的活性[10]，這種相互作用在創(chuàng)傷愈合的過(guò)程中促進(jìn)了創(chuàng)面組織中膠原的降解，防止創(chuàng)面膠原過(guò)度沉積導(dǎo)致瘢痕形成[11-12]。

防腐生肌膏是由血竭、乳香、沒(méi)藥、紫草、三七等中藥組成制備的油膏。本方是在傳統(tǒng)防腐生肌散原方的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)篩選、優(yōu)化制備而成的外用治療創(chuàng)傷愈合的膏劑。本試驗(yàn)就是應(yīng)用制備好的防腐生肌膏作用于大鼠的皮膚破損模型，觀察防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面肉芽組織中基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑表達(dá)量的測(cè)定，來(lái)闡明防腐生肌膏在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠50只，雌雄各半，體重200 g±20 g，購(gòu)自哈爾濱漢方實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心；防腐生肌膏主要由血竭、乳香、沒(méi)藥、三七、紫草、黃柏、冰片(哈爾濱市藥材公司產(chǎn)品)組成，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備；大鼠MMP-1 ELISA試劑盒、大鼠MMP-2 ELISA試劑盒、大鼠MMP-9 ELISA試劑盒、大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒、大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒，上海北諾生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物皮膚缺損模型的制備及給藥方法 健康SD大鼠50只，常規(guī)飼養(yǎng)，7 d后開(kāi)始造模。造模前用犬眠寶麻醉大鼠，麻醉后的大鼠俯臥固定，背部正中左右兩側(cè)距脊柱1 cm處各選擇1塊5 cm×5 cm的完整皮膚，100 g/L硫化鈉脫毛處理，生理鹽水清洗擦干局部涂抹碘酊進(jìn)行消毒，選用自體對(duì)照法，在大鼠背部設(shè)定皮膚右側(cè)為防腐生肌膏組，左側(cè)為空白對(duì)照組，在脫毛處剪成2 cm×2 cm的傷口，深達(dá)肌筋膜，大鼠分籠進(jìn)行飼養(yǎng)，并給以充足的水和食物。防腐生肌膏組的創(chuàng)面每天進(jìn)行常規(guī)消毒，涂抹防腐生肌膏，厚度約2 mm，每天1次，至完全愈合；空白對(duì)照組的創(chuàng)面每日常規(guī)消毒，涂抹20 g/L碘酊[13]。

1.2.2 樣品采集 造模后第3、7、10、14天，隨機(jī)選取每組各10只大鼠取樣，使用乙醚麻醉，剪刀剪取大鼠創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣正常皮膚間的新生的肉芽組織部分，約0.5 cm2，置-80℃冰箱中保存。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 將采集的樣本與PBS 1∶9進(jìn)行研磨，3 000 r/min離心20 min，取上清，分裝后置于-20℃?zhèn)溆?。采用ELISA檢測(cè)上清中的 MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的含量，重復(fù)3次[14]。

2 結(jié)果

2.1 防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面組織表達(dá)MMP-1調(diào)節(jié)

創(chuàng)傷后第1天，防腐生肌膏組與對(duì)照組創(chuàng)面都開(kāi)始表達(dá)MMP-1，兩組比較差異不顯著(P>0.05)。創(chuàng)傷后第3天，防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-1的表達(dá)量最高，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。創(chuàng)傷后第7天、第10天、第14天，隨著創(chuàng)傷時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸減弱，且防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-1表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖1)。

與對(duì)照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)，*代表差異顯著(P<0.05)

** represents extremely significant difference (P<0.01),* shows significant difference (P<0.05),compared with the control group

圖1防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面MMP-1表達(dá)的影響

Fig.1 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression of
MMP-1 in the wound

2.2 防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面組織表達(dá)MMP-2調(diào)節(jié)

創(chuàng)傷后第1天，防腐生肌膏組與對(duì)照組開(kāi)始表達(dá)MMP-2，兩組差異不顯著；創(chuàng)傷后第3天、第7天防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-2表達(dá)量逐漸增加，第10天達(dá)到高峰，之后開(kāi)始減弱；創(chuàng)傷后第10天、第14天，表達(dá)量與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

與對(duì)照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖2防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面MMP-2表達(dá)的影響

Fig.2 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of MMP-2 in the wound

2.3 防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面組織表達(dá) MMP-9 調(diào)節(jié)

創(chuàng)傷第1天，防腐生肌膏組與對(duì)照組都開(kāi)始表達(dá)MMP-9，隨著創(chuàng)傷時(shí)間延長(zhǎng)，在創(chuàng)傷后第3天達(dá)到表達(dá)高峰，之后逐漸減弱。防腐生肌膏組與對(duì)照組比較，防腐生肌膏能極顯著促進(jìn)創(chuàng)面表達(dá)MMP-9(P<0.01)(圖3)。

2.4 防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面組織表達(dá) TIMP-1 調(diào)節(jié)

創(chuàng)傷開(kāi)始后，創(chuàng)面就開(kāi)始表達(dá)TIMP-1，隨著創(chuàng)傷時(shí)間延長(zhǎng)，防腐生肌膏組與對(duì)照組比較，TIMP-1的表達(dá)量逐漸減少，并且極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖4)。

與對(duì)照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖3防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面MMP-9表達(dá)的影響

Fig.3 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of MMP-9 in the wound

與對(duì)照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖4防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面TIMP-1表達(dá)的影響

Fig.4 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of TIMP-1 in the wound

2.5 防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面表達(dá) TIMP-2 調(diào)節(jié)

創(chuàng)傷開(kāi)始后，創(chuàng)面就開(kāi)始表達(dá)TIMP-2，隨著創(chuàng)傷時(shí)間延長(zhǎng)，防腐生肌膏組與對(duì)照組比較，TIMP-2表達(dá)量逐漸減少，并且極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖5)。

與對(duì)照組相比較，**代表差異極顯著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

圖5防腐生肌膏對(duì)創(chuàng)面TIMP-2表達(dá)的影響(ng/mL)

Fig.5 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of TIMP-2 in the wound(ng/mL)

3 討論

創(chuàng)傷發(fā)生后，肉芽組織的快速生長(zhǎng)能夠促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。肉芽組織主要成分為膠原，主要包括Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原?；|(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制調(diào)控膠原劑的合成與分解。因此，在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制在組織中的含量變化，體現(xiàn)了膠原在創(chuàng)口中的積累，代表創(chuàng)口填充的快慢。在創(chuàng)傷修復(fù)中，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9促進(jìn)膠原的分解，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1、TIMP-2抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。因此，檢測(cè)MMP-1、MMP-2、MMP-9與TIMP-1、TIMP-2含量變化，可以推知膠原在傷口的積累情況。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，創(chuàng)傷第1天，防腐生肌膏組與對(duì)照組創(chuàng)面都開(kāi)始表達(dá)MMP-1、MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2，這主要是因?yàn)閯?chuàng)傷早期成纖維細(xì)胞及各種炎性細(xì)胞開(kāi)始分泌一定量的MMP和TIMP，目的為抑制早期的炎癥反應(yīng)。隨著創(chuàng)傷時(shí)間的延長(zhǎng)，創(chuàng)傷后第3天，防腐生肌膏組創(chuàng)面MMP-1的表達(dá)量達(dá)到最高，之后表達(dá)量逐漸減少；MMP-2的表達(dá)量隨創(chuàng)傷時(shí)間逐漸增加，第10天達(dá)到高峰，之后開(kāi)始減弱；MMP-9的表達(dá)量創(chuàng)傷后第3天達(dá)到表達(dá)高峰，之后逐漸減弱。從三者的表達(dá)量看，防腐生肌膏組均高于對(duì)照組，且差異顯著。研究發(fā)現(xiàn)，血竭中的血竭素高氯酸鹽對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性降低Ⅰ、Ⅲ型前膠原的表達(dá)而抑制成纖維細(xì)胞合成膠原促進(jìn)成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。血竭為防腐生肌膏中的主要藥物，試驗(yàn)中防腐生肌膏通過(guò)提高M(jìn)MP-1、MMP-2及MMP-9的表達(dá)促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原降解來(lái)調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合防止瘢痕組織形成的結(jié)果相一致。Krieglstein C F等[16]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)試驗(yàn)性腸炎模型的SD大鼠，乳香提取物和11-羰基-β-乙酰乳香酸單體均可以明顯減輕組織損傷程度，具有抗炎作用。組方中乳香、沒(méi)藥的配伍從中醫(yī)理論的角度理解，其所涵蓋的藥物相互作用表現(xiàn)為同氣相求，現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，兩藥配伍的藥效作用通常呈現(xiàn)為藥理作用的協(xié)同增效[17]。另外，方中紫草的活性成分也具有抗炎作用[18]。而方中三七中的活性成分對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用[19-20]，縮小瘢痕組織，提高傷口愈合質(zhì)量。防腐生肌膏方中諸藥的共同作用下，調(diào)節(jié)膠原代謝，促進(jìn)組織愈合，減少瘢痕產(chǎn)生。

防腐生肌膏能通過(guò)促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的一個(gè)重要機(jī)制是通過(guò)調(diào)控MMP-1、MMP-2、MMP-9與TIMP-1、TIMP-2的活性，調(diào)節(jié)膠原代謝，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。