邵明園，賴 泳

(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院/云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000)

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展過(guò)程中引起的肝臟內(nèi)包括膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積和降解失衡的一種傷口愈合反應(yīng)，是肝硬化、肝癌和肝功能衰竭形成的必經(jīng)階段，嚴(yán)重危害人類的健康[1-3]。研究表明，肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的增殖和活化，肝星狀細(xì)胞是產(chǎn)生ECM的重要細(xì)胞，肝纖維化及早期肝硬化是可逆的[1,4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)能特異性降解ECM，MMPs能與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)結(jié)合形成復(fù)合物，從而抑制MMPs的活性。因此，提高M(jìn)MPs的活性或抑制TIMPs的表達(dá)，可促進(jìn)ECM的降解并抑制肝纖維化[5-7]。目前，還沒(méi)有特效藥可以治療肝纖維化。肝龍膠囊的主要成分是美洲大蠊提取物，肝龍膠囊和水飛薊賓都具有抗肝炎、保肝的作用[8-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝龍膠囊合用水飛薊賓能顯著降低人肝星狀細(xì)胞中Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)mRNA的表達(dá)，且可以增強(qiáng)水飛薊賓的抗肝纖維化作用。本研究采用豬血清誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，旨在探討肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中Col-Ⅰ和TIMP-1 m RNA的表達(dá)影響，為臨床評(píng)價(jià)肝龍膠囊聯(lián)合水飛薊賓治療肝纖維化提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠72只，體重180 g±200g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 藥物及試劑 水飛薊賓膠囊(批號(hào)16041601)，天津天士力圣特制藥有限公司產(chǎn)品；肝龍膠囊(批號(hào)550706087)，昆明賽諾制藥有限公司產(chǎn)品；豬血清(批號(hào)20210922)，北京燕生政博生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC，批號(hào)729b028)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；Trizol(批號(hào)49164)，北京普博斯生物科技有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；SYBR Green Bestar?qPCR Mastermix(批號(hào)P-2020938)，上海星漢生物科技有限公司產(chǎn)品；6×Loading burffer(批號(hào)A6601A)，日本TakaRa公司產(chǎn)品；M-MLV Reverse Transcriptase OMEGA (Cat:TQ2401-01)、10×mmol/L dNTP mix(批號(hào)00322735)、RiboLock RNase Inhibitor(批號(hào)00327353)，美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；DNA Marker D 2 000(批號(hào)H7104)，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Biowest瓊脂糖(批號(hào)111760)，北京基因科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 2720型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；G：BOX 凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Syngene公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；Smart Spec Plus型核酸蛋白測(cè)定儀、CFX96TMreal-time Systerm，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型復(fù)制和標(biāo)本收集 將72只雄性SD健康成年大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，完全隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊賓組、肝龍膠囊低劑量組、肝龍膠囊中劑量組、肝龍膠囊高劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊低劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊中劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊高劑量組，每組8只。正常組給予9 g/L生理鹽水，其余組均給予未滅活豬血清腹腔注射，每次0.5 mL/只，2次/周，連續(xù)10周；于第11周灌胃給藥，正常組和模型組給予等量的蒸餾水，其余組給予相應(yīng)劑量的藥物。水飛薊賓膠囊劑量，7 mg/kg，3次/d；肝龍膠囊低劑量，120 mg/kg，2次/d；肝龍膠囊中劑量，60 mg/kg，2次/d；肝龍膠囊高劑量，30 mg/kg，2次/d；所有給藥容量為0.5 mL/100 g。于16周末處死大鼠，取大鼠肝組織保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Real-time PCR方法檢測(cè)肝組織Col-Ⅰ、TIMP-1 mRNA的表達(dá)

1.2.2.1 總RNA抽提 取凍存的大鼠肝組織約50 mg，加入1 mL的Trizol，在冰浴狀態(tài)下勻漿，至無(wú)肉眼可見(jiàn)組織，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)操作步驟提取總RNA。以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定各個(gè)RNA樣本的純度和濃度，OD260/OD280在1.8～2.0之間表示合格。提取的總RNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 總RNA逆轉(zhuǎn)錄 按照RevertAidTM M-MuLv逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)操作，取1 μg總RNA以1 μL OD 18為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將合成好的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中Col-Ⅰ、TIMP-1和β-actin(做內(nèi)參)設(shè)計(jì)引物：Col-Ⅰ引物序列號(hào)為：NM-053304.1，上游引物序列為：5′-CAGTCGATTCACCTACAGCACG-3′，下游引物序列為：5′-GGGATGGAGGGAGTTTACACG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為201 bp；TIMP-1引物序列號(hào)為：NM-053819.1，上游引物序列為：5′-GATATGTCCACAAGTCCCAGAACC-3′，下游引物序列為：5′-CCACAGCCAGCACTATAGGTCTTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為163 bp；內(nèi)參β-actin引物序列號(hào)為：NM-031144.3，上游引物序列：5′-GTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物序列：5′-GAGGCATACAGGGACAACA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度201 bp。所有引物均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

1.2.2.4 PCR測(cè)序 隨機(jī)抽取樣本進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物取5 μL于20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，并將產(chǎn)物進(jìn)行PCR測(cè)序。

1.2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物驗(yàn)證 使用CFX96 real-time PCR Detection System進(jìn)行PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析，采用SYBR法。取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 2 μL為模板，配制反應(yīng)體系：10 μL Bestar?SybrGreen qPCR mastermix，前后引物各0.5 μL，滅菌雙蒸水為8 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 2 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s(β-actin退火溫度為46℃)，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后進(jìn)行溶解曲線分析，95℃ 5 s,65℃ 5 s，每個(gè)循環(huán)增加0.5℃?？傻玫綌U(kuò)增曲線、融解曲線和待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果采用比較CT法定量，計(jì)算方法為：2-ΔΔCT法。根據(jù)2-ΔΔCT值計(jì)算Col-Ⅰ、TIMP-1及β-actin基因的起始模板量，從而反映出Col-Ⅰ、TIMP-1在不同樣本中的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的完整性檢測(cè)

提取的總RAN上樣于20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可以看到28 S、18 S、5 S RNA條帶，說(shuō)明RNA完整性好；且28 S和18 S的亮度比約為2∶1，表明RNA無(wú)降解(圖1)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線

將RNA逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR融解曲線分析，可以看到單一的峰型，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物有較高的特異性(圖2)。

1，2.空白組；3.模型組；4.水飛薊賓組；5.肝龍膠囊低劑量組；6.肝龍膠囊中劑量組；7.肝龍膠囊高劑量組；8.水飛薊賓+肝龍膠囊低劑量組；9.水飛薊賓+肝龍膠囊中劑量組；10.水飛薊賓+肝龍膠囊高劑量組

1,2.Control group; 3.Model group; 4.Silibinin group; 5.Ganlong capsule low dose group; 6.Ganlong capsule middle dose group; 7.Ganlong capsule high dose group; 8.Silibinin+Ganlong capsule low dose group; 9.Silibinin+Ganlong capsule middle dose group; 10.Silibinin+Ganlong capsule high dose group

圖1肝組織RNA瓊脂糖凝膠電泳

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of liver tissue RNA

A.Ⅰ型膠原；B.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1；C.β-肌動(dòng)蛋白A.Col-Ⅰ；B.TIMP-1；C.β-actin

2.3 PCR測(cè)序結(jié)果

將純化后的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，Col-Ⅰ測(cè)序結(jié)果與GenBank(Gene ID：29393)上公布的序列一致；TIMP-1測(cè)序結(jié)果與GenBank(Gene ID：116510)上公布的序列一致；β-actin測(cè)序結(jié)果與GenBank(Gene ID：81822)上公布的序列一致，測(cè)序結(jié)果如圖3(截取部分)。

2.4 肝龍膠囊聯(lián)用水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Col-Ⅰ mRNA的表達(dá)影響

大鼠肝組織中Col-Ⅰ mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組、肝龍膠囊低劑量組、肝龍膠囊高劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊低劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊中劑量組均能增加Col-Ⅰ mRNA的表達(dá)，分別增加了4.08、0.13、1.46、0.31、15.54倍(P<0.05)；水飛薊賓組、肝龍膠囊中劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊高劑量組能降低Col-Ⅰ mRNA的表達(dá)，分別降低了0.36、0.65、0.25倍(P<0.05)。與模型組相比較，水飛薊賓組、肝龍膠囊低、中、高劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊低劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊高劑量組均能顯著降低大鼠肝組織中Col-Ⅰ mRNA的表達(dá)，分別降低了4.44、3.95、4.73、2.62、3.77、4.33倍(P<0.05)。水飛薊賓和肝龍膠囊都能降低Col-Ⅰ mRNA的相對(duì)表達(dá)量；肝龍膠囊聯(lián)用水飛薊賓對(duì)Col-Ⅰ mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)低、高濃度抑制，中濃度促進(jìn)的作用(表1)。

2.5 肝龍膠囊聯(lián)用水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1 mRNA的表達(dá)影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白組比較，水飛薊賓組、肝龍膠囊中劑量組和肝龍膠囊高劑量組對(duì)TIMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別降低了0.62、0.49、0.35倍(P<0.05)；與模型組相比，水飛薊賓組、肝龍膠囊低、中、高劑量組、水飛薊賓+肝龍膠囊低、高劑量組均能降低肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1 mRNA的表達(dá)，分別降低了15.73、15.09、15.6、15.46、14.02、15.05倍(P<0.05)；肝龍膠囊對(duì)TIMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)中、高濃度抑制，低濃度促進(jìn)的作用；肝龍膠囊聯(lián)用水飛薊賓對(duì)TIMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)呈現(xiàn)低、高濃度抑制，中濃度促進(jìn)的作用(表2)。

3 討論

肝纖維化是指由于各種慢性肝病導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，肝臟內(nèi)ECM過(guò)度沉積的病理過(guò)程。肝纖維化是可逆的，若不及時(shí)治療，持續(xù)發(fā)展可引起肝硬化和肝細(xì)胞癌。因此，獲得有效的治療方法及有效藥物顯得極為重要，成功復(fù)制肝纖維化動(dòng)物模型是研究肝纖維化的前提。由于豬血清作為異種血清，在機(jī)體中可產(chǎn)生免疫復(fù)合物進(jìn)而發(fā)生一系列變態(tài)反應(yīng)，誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化與人類肝炎中肝纖維化發(fā)生存在一定相似之處，并且對(duì)肝細(xì)胞無(wú)損傷，較四氯化碳法所致肝纖維化模型穩(wěn)定，造模時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)物存活率高，因此本試驗(yàn)采用豬血清法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化[12-14]。

A.Ⅰ型膠原；B.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1；C.β-肌動(dòng)蛋白A.Col-Ⅰ ；B.TIMP-1；C.β-actin

組別Group劑量/(mg·kg-1)DoseⅠ型膠原 mRNA(2-ΔΔCT)Col-Ⅰ mRNA(2-ΔΔCT)空白組 Control group-1.00±0.153,6)模型組 Model group-5.08±2.031,6)水飛薊賓組 Silibinin group70.64±0.082,4)肝龍膠囊低劑量組 Ganlong capsule low dose group301.13±1.646)肝龍膠囊中劑量組 Ganlong capsule middle dose group600.35±0.193,6)肝龍膠囊高劑量組 Ganlong capsule high dose group1202.46±0.922,4)水飛薊賓+肝龍膠囊低劑量組 Silibinin+Ganlong capsule low dose group7+301.31±0.264,5)水飛薊賓+肝龍膠囊中劑量組 Silibinin+Ganlong capsule middle dose group7+6016.54±1.244)水飛薊賓+肝龍膠囊高劑量組 Silibinin+Ganlong capsule high dose group7+1200.75±0.661,4)

注：1)P<0.05，2)P<0.01 vs空白組；3)P<0.05，4)P<0.01 vs模型組；5)P<0.05，6)P<0.01 vs水飛薊賓組。

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05，4)P<0.01 vs model group；5)P<0.05，6)P<0.01 vs silibinin group.

表2 肝龍膠囊聯(lián)用水飛薊賓對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1 mRNA的表達(dá)影響±s，n=8)

注：1)P<0.05，2)P<0.01 vs空白組；3)P<0.05，4)P<0.01 vs模型組；5)P<0.05，6)P<0.01 vs水飛薊賓組。

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05，4)P<0.01 vs model group；5)P<0.05，6)P<0.01 vs silibinin group.

肝纖維化時(shí)，肝星狀細(xì)胞被激活，合成大量ECM，ECM的主要成分是Col-Ⅰ和Ⅲ型膠原。ECM的沉積和降解與MMPs和TIMPs有關(guān)，MMPs能降解ECM，而TIMPs能與MMPs以1∶1結(jié)合為復(fù)合物而抑制MMPs的活性。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-1 主要降解 Col-Ⅰ和Ⅲ型膠原，MMP-13則主要降解Col-Ⅰ；而TIMP-1主要能抑制MMP-1和MMP-13的活性，所以降低TIMP-1的表達(dá)可以抑制肝纖維化的發(fā)展[14-16]。

本研究結(jié)果表明，大鼠肝纖維化時(shí)Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA表達(dá)均升高，給予水飛薊賓治療后，Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低；給予肝龍膠囊治療后，只有肝龍膠囊中劑量組能顯著降低Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA表達(dá)水平；兩者聯(lián)合治療時(shí)，水飛薊賓聯(lián)合肝龍膠囊低、高劑量組能降低Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA的表達(dá)。此結(jié)果提示：水飛薊賓能通過(guò)下調(diào)Col-Ⅰ、TIMP-1 mRNA的表達(dá)，發(fā)揮抗肝纖維化的作用；肝龍膠囊中劑量組對(duì)大鼠肝纖維化有顯著抑制作用；水飛薊賓聯(lián)合肝龍膠囊作用于免疫性肝纖維化大鼠時(shí)，水飛薊賓聯(lián)合肝龍膠囊中劑量組能明顯增加Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA的表達(dá)，其可能原因?yàn)椋孩俑锡埬z囊的化學(xué)成分復(fù)雜，主要有信息素、氨基酸、昆蟲(chóng)神經(jīng)肽、糖類、蛋白質(zhì)、油脂、核酸類、異黃酮[17-18]等，由此進(jìn)入機(jī)體后進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物促進(jìn)ECM沉積，增加TIMP-1的合成，促進(jìn)肝纖維化；②肝纖維化病理因素及病理過(guò)程復(fù)雜，肝龍膠囊和水飛薊賓作為中藥，作用于肝纖維化存在多層次多靶點(diǎn)的作用。