劉佳佳，吳 彤，梅 琳，韓雪清，吳紹強(qiáng)，林祥梅，王慧煜*

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.內(nèi)蒙古開魯縣家畜改良工作站，內(nèi)蒙古開魯 028400)

布魯菌病(Brucellosis)(簡稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的重大人畜共患病，以侵害動(dòng)物生殖系統(tǒng)，引起動(dòng)物流產(chǎn)和不孕不育為特征[1]。進(jìn)入21世紀(jì)，布魯菌病疫情日趨加重，呈現(xiàn)從牧區(qū)、半牧區(qū)向農(nóng)區(qū)甚至城市蔓延的趨勢，被WHO稱為“再度肆虐”的傳染病。包括美國等發(fā)達(dá)國家在內(nèi)的170多個(gè)國家和地區(qū)都發(fā)生過或正在發(fā)生布病，這些國家大都與我國有貿(mào)易往來，更為嚴(yán)重的是我國周邊國家疫情頻頻發(fā)生(如蒙古國、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦等)[2-3]，給我國布魯菌病防控帶來新的挑戰(zhàn)。

我國針對動(dòng)物布魯菌病的防控以檢疫、撲殺和免疫綜合治理為主，布魯菌病的快速、準(zhǔn)確診斷可為疫病防控提供有效的疫情信息，是早期防控的關(guān)鍵。細(xì)菌學(xué)診斷方法作為布魯菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果雖然具有較高的精確度，但是易污染、耗時(shí)長，且不易分離，并且對工作人員的威脅較大?；跈z測布魯菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的血清學(xué)診斷方法，如虎紅平板凝集試驗(yàn)(rose-bengal plate agglutination test，RBPT)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test，CFT)，是世界范圍內(nèi)較為認(rèn)可的方法[4-5]，但因存在實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)，在大量樣品的實(shí)地檢測中應(yīng)用較少。而基于布魯菌全菌作為抗原的ELISA檢測方法亦不適合現(xiàn)場檢測[6]。因此，建立一種快速并適合現(xiàn)場使用的診斷方法非常必要。研究發(fā)現(xiàn)布魯菌外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)在免疫和診斷方面有著顯著的優(yōu)勢，可作為替換LPS的診斷抗原[7-8]。其中，OMP22作為一種免疫優(yōu)勢抗原，在各種屬之間的保守性很高，是布魯菌重要的毒力因子，是制造疫苗和抗體必不可少的抗原。

免疫層析技術(shù)作為發(fā)展較為迅速的快速檢測技術(shù)之一，以其簡便、快速、特異性強(qiáng)、易于肉眼判斷、不需輔助儀器和試劑、結(jié)果易于保存等特點(diǎn)，特別適合基層和現(xiàn)場初篩使用。其中，以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物的免疫層析試紙條，因其特有的光電磁信號放大系統(tǒng)可以提高檢測的靈敏度，減少樣品底色干擾，不存在膠體金顯色難的問題，展現(xiàn)出更廣的發(fā)展前景[9-10]。本研究采用原核表達(dá)的牛布魯菌OMP22蛋白作為檢測抗原，以帶熒光標(biāo)記的抗體作為標(biāo)記物，建立一種布魯菌熒光標(biāo)記免疫層析試紙條檢測方法，以期為基層單位在現(xiàn)場快速準(zhǔn)確初篩牛布魯菌病提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與血清 pCold-TF/OMP22原核重組表達(dá)質(zhì)粒為中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)檢所構(gòu)建保存；牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛結(jié)核病血清、牛藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、?？谔阋哐?、牛巴氏桿菌病血清、牛白血病血清，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)檢所保存。

1.1.2 主要試劑 熒光標(biāo)記羊抗牛IgG，上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司產(chǎn)品；兔抗羊IgG，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；玻璃纖維(GF-08)、玻璃纖維墊(8964)、吸水紙(H-5076)、黑色底板(國產(chǎn))和硝酸纖維素膜(HFC13502)，上海捷寧生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 三維噴點(diǎn)系統(tǒng)(Biodot-XYZ3050TM)、切紙機(jī)系統(tǒng)(Biodot-CM4000TM)，百道貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品；手持式紫外燈(BG-42-A)由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供；超純水系統(tǒng)，美國Milipore公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A)，上海中友儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的表達(dá)與純化 將pCold-TF/OMP22原核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌至菌液OD 600 nm值為0.6左右，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集菌液。

收集誘導(dǎo)后的菌體沉淀，加入結(jié)合緩沖液重懸菌體后進(jìn)行超聲破碎至菌液澄清透明，于4℃離心后，取上清過層析柱(按照QIAGEN公司的NI-NTA agrose說明書進(jìn)行操作)。先以含低濃度咪唑(10、20、50 mmol/L)的緩沖液洗脫去除雜蛋白，再以含250 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。

1.2.2 重組蛋白的反應(yīng)原性鑒定 將純化好的OMP22蛋白(蛋白濃度1 μg/mL)，以每孔100 μL的量包被于酶標(biāo)板上，4℃過夜。用100 mL/L馬血清室溫封閉1 h，以1∶100稀釋的布魯菌標(biāo)準(zhǔn)血清作為一抗，以1∶20 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛IgG作為二抗進(jìn)行重組蛋白的ELISA反應(yīng)原性分析。最后，用TMB底物顯色液室溫避光反應(yīng)10 min，用硫酸溶液終止顯色反應(yīng)，讀取OD 450 nm值。

1.2.3 熒光標(biāo)記免疫層析試紙條的組裝

1.2.3.1 樣品墊和結(jié)合墊的預(yù)處理 將樣品墊和結(jié)合墊浸泡在含有表面活性劑10 g/L Triton100和30 g/L BSA的PBS(pH 7.4)緩沖液中，于4℃條件下浸泡2 h，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)的反應(yīng)性鑒定 將熒光標(biāo)記羊抗牛IgG噴涂在結(jié)合墊上，兔抗羊IgG包被在NC膜上，利用濕法將蒸餾水滴加到樣品墊位置去爬膜，觀察C線的顯色情況。若C線出現(xiàn)，表明整個(gè)試紙條層析過程是有效的；若未出現(xiàn)，表明該反應(yīng)失敗。

將熒光標(biāo)記羊抗牛IgG噴涂在結(jié)合墊上，OMP22蛋白包被在NC膜上，利用濕法將牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清滴加到樣品墊位置去爬膜，觀察T線的顯色情況。若T線出現(xiàn)，說明陽性血清中的抗體與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合形成復(fù)合物后，又與T線上包被的牛布魯菌重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，表明該試紙條具有檢測能力。

1.2.3.3 抗體濃度的優(yōu)化 結(jié)合墊上熒光標(biāo)記抗體濃度及C線包被的二抗?jié)舛仁怯绊憻晒庑盘枏?qiáng)弱的決定因素，可檢測到最小熒光信號的量為試紙條包被抗體的最佳用量。根據(jù)棋盤法原理，使用濃度為1.5 、0.75、0.375 mg/mL的熒光標(biāo)記羊抗牛IgG，和濃度為0.500、0.250、0.125 mg/mL的兔抗羊IgG兩兩組合進(jìn)行包被，具體優(yōu)化方案見表1。

表1 熒光標(biāo)記羊抗牛IgG與兔抗羊IgG的濃度梯度

1.2.3.4 硝酸纖維素膜的預(yù)處理 將劃好C線∶兔抗羊IgG和T線∶OMP22蛋白的NC膜置于37℃烘箱中干燥2 h后，用含10 g/L BSA和5 mL/L Tween 20的PBS(pH 7.4)緩沖液浸泡2 h，于37℃烘箱中干燥4 h后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.5 試紙條的組裝及結(jié)果判定 在水平桌面，將包被有T線和C線的NC膜按照黏性PVC(300 mm×60 mm)底板劃分好的位置黏貼，要求左右對齊，不要超出所劃分的NC膜所在位置，然后輕輕抹平膜面；將裁剪成300 mm×2 mm的包被有熒光標(biāo)記抗體的玻璃纖維素膜，在NC膜的左側(cè)壓住NC膜1 mm處，黏貼到PVC底板上；將300 mm×19 mm的作為樣品墊的玻璃纖維素膜，在結(jié)合墊左側(cè)并壓住結(jié)合墊1 mm處，黏貼到PVC底板上；最后，將300 mm×16 mm吸水墊靠NC膜右側(cè)并壓住NC膜1 mm，黏貼到PVC底板上。用切條機(jī)切成4.0 mm寬的試紙條，與干燥劑一起裝人鋁箔袋中密封，于4℃保存。

檢測血清時(shí)，T線和C線在紫外燈的照射下均出現(xiàn)紫色線，則為布魯菌抗體陽性；若質(zhì)控線無紫色線出現(xiàn)，則該試紙條無效。

1.2.4 試紙條的敏感性檢測 使用同一批次試紙條檢測稀釋度為1∶10、1∶50、1∶100、1∶200和1∶500的牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，將出現(xiàn)陽性信號的血清最高稀釋度作為試紙條的敏感度。

1.2.5 試紙條的特異性檢測 使用同一批次試紙條分別檢測牛結(jié)核病血清、牛藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、?？谔阋哐濉⑴０褪蠗U菌病血清、牛白血病和牛布魯菌病血清，觀察有無交叉性，判斷試紙條的特異性。

1.2.6 試紙條的重復(fù)性檢測 使用同一批次及不同批次的試紙條分別檢測牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.2.7 血清樣品的檢測 使用同一批次的熒光免疫層析試紙條對200份牛血清樣品(用PBS緩沖液1∶50稀釋)進(jìn)行檢測，5 min后記錄結(jié)果。同時(shí)以IDEXX試劑盒(標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測方法)作為對比參照，計(jì)算兩種檢測方法檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的純化及ELISA鑒定

由圖1結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)的牛布魯菌重組蛋白OMP22(74 ku)為可溶性表達(dá)，經(jīng)NI-NIA agrose親和層析純化后，獲得了純度較高的蛋白。將OMP22作為包被抗原，對牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血清進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果與預(yù)期一致，說明該抗原可作為診斷抗原應(yīng)用于試紙條的研制工作中。

2.2 質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)的反應(yīng)性

熒光標(biāo)記羊抗牛IgG和兔抗羊IgG可以發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，C線顯色情況良好。熒光標(biāo)記羊抗牛IgG可與牛布魯菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清結(jié)合，并隨著毛細(xì)作用繼續(xù)向前流動(dòng)至T線處，與布魯菌重組外膜蛋白OMP22抗原發(fā)生反應(yīng)，使T線顯色。

2.3 抗體的最佳濃度

對熒光標(biāo)記羊抗牛IgG和兔抗羊IgG濃度進(jìn)行梯度檢測，試紙條T線羊抗牛IgG的最佳標(biāo)記濃度為0.75 mg/mL，C線兔抗羊IgG的最佳濃度為0.5 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組表達(dá)菌裂解液上清；2.重組表達(dá)菌裂解液沉淀；3.純化的重組蛋白

M.Protein molecular weight Marker; 1.Supernatant of the lysed recombinantE.coliBL21(DE3); 2.Precipiate of the lysed recombinantE.coliBL21(DE3); 3.Purified recombinant protein

圖1重組蛋白OMP22的SDS-PAGE電泳分析

Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein OMP22

2.4 熒光標(biāo)記免疫層析試紙條檢測結(jié)果

2.4.1 檢測布魯菌抗體結(jié)果 用制作的免疫層析試紙條檢測牛布魯菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血清，結(jié)果顯示陽性血清呈陽性，陰性血清呈陰性，說明該試紙條具備檢測能力(圖2)。

1.陽性標(biāo)準(zhǔn)血清；2.陰性標(biāo)準(zhǔn)血清1.Positive standard serum; 2.Negative standard serum

2.4.2 特異性檢測 用熒光標(biāo)記免疫層析試紙條同時(shí)檢測牛結(jié)核病血清、牛藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、?？谔阋哐濉⑴０褪蠗U菌病血清、牛白血病和牛布魯菌病血清。結(jié)果顯示，除牛布魯菌病血清呈陽性外，其他均為陰性(圖3)。

2.4.3 敏感性檢測 以O(shè)MP22蛋白作為檢測抗原，熒光免疫層析試紙條最低可檢出1∶100稀釋的牛布魯菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(圖4)。

2.4.4 重復(fù)性檢測 用同一批試紙條分別檢測20份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和20份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，重復(fù)3次，得到的結(jié)果保持一致，說明該方法的重復(fù)性較好。

2.4.5 樣品檢測結(jié)果 使用IDEXX試劑盒對200份牛血清樣品進(jìn)行檢測，陽性結(jié)果31份；使用熒光免疫層析試紙條進(jìn)行檢測，陽性結(jié)果29份。以IDEXX試劑盒的檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，試紙條檢出的29份陽性樣品全部來源于31份陽性樣品之中，兩種試驗(yàn)方法的符合率為93.5%。

1.牛結(jié)核病血清；2.牛藍(lán)舌病血清；3.牛病毒性腹瀉血清；4.?？谔阋哐澹?.牛巴氏桿菌病血清；6.牛白血病血清；7.牛布魯菌病血清

1.Bovine tuberculosis serum; 2.Bovine serum of blue tongue disease; 3.Serum of bovine viral diarrhea; 4.Bovine serum of foot and mouth disease; 5.Bovine serum of pasteurellosis; 6.Bovine leukemia serum; 7.Bovine serum of brucellosis serum

圖3試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3 The specificity test results of test strip

圖4 試紙條敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

布魯菌病是最重要的人畜共患病之一，其流行與傳播給全世界畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生事業(yè)帶來了較為嚴(yán)重的威脅，對其防控已成為全球關(guān)注的重大社會(huì)公共衛(wèi)生問題。血清學(xué)診斷方法是布魯菌病常用的診斷方法之一，而以LPS作為包被抗原的ELISA、虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)等方法，由于操作步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)，或結(jié)果常常存在假陽性和交叉反應(yīng)，因此在實(shí)際操作中應(yīng)用較少[11-12]。布魯菌外膜蛋白具有較好的免疫原性和抗原保護(hù)作用，在免疫和診斷方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[13-14]。OMP22蛋白作為一種免疫優(yōu)勢抗原，歐建偉等[8]和Martín-Martín A I等[15-16]報(bào)道，缺失OMP22基因的綿羊附睪布魯菌在侵染HeLa細(xì)胞和J774.A1細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖分裂能力有所下降，說明OMP22基因可能與布魯菌的感染力和毒性有關(guān)。Caro-Hernández P等[17]也發(fā)現(xiàn)，缺失OMP22基因的B.ovisPA菌株在脾臟的增殖明顯減少、穩(wěn)定期生長不良以及抗體檢測呈陰性等情況。本研究采用NI-NTA agrose親和層析方法純化牛布魯菌OMP22外膜蛋白，并通過ELISA方法驗(yàn)證其反應(yīng)性。根據(jù)ELISA方法檢測布魯菌的陽性值最低判定標(biāo)準(zhǔn)，OMP22抗原具有很好的反應(yīng)原性，可作為診斷抗原應(yīng)用于牛布魯菌的快速檢測中。

免疫層析技術(shù)作為一種可以滿足基層檢疫部門“簡便、準(zhǔn)確、易判定”要求的檢測技術(shù)，正逐步向定量、高靈敏度、多標(biāo)記檢測等方向發(fā)展，而免疫層析試紙條是應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測的必然發(fā)展趨勢。以熒光物質(zhì)作為檢測信號，以其特有的光電磁信號放大系統(tǒng)提高檢測靈敏度，可減少樣品底色干擾因素，既繼承了膠體金免疫層析法操作便捷、可現(xiàn)場檢測的優(yōu)勢，又利用熒光持續(xù)穩(wěn)定的特性，較好地克服了膠體金免疫層析法結(jié)果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。因此，本研究采用間接法，將帶熒光標(biāo)記的羊抗牛IgG噴涂于結(jié)合墊，以純化的布魯菌外膜蛋白OMP22作為抗原包被在NC膜的特定位置作為T線，針對和信號物偶聯(lián)的兔抗羊IgG包被在NC膜的特定位置作為C線，制作檢測布魯菌抗體熒光免疫層析試紙條。結(jié)果表明，該方法特異性好，與牛結(jié)核病血清、牛藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、?？谔阋哐濉⑴０褪蠗U菌病血清、牛白血病血清均無交叉反應(yīng)；血清樣品檢測結(jié)果與IDEXX試劑盒的符合率為93.5%，說明該方法在實(shí)際應(yīng)用過程中與IDEXX試劑盒ELISA檢測方法的使用效果基本相同，但偶爾也會(huì)出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，可能與包被抗原的反應(yīng)原性不夠好有關(guān)，所以仍需要進(jìn)一步對試驗(yàn)所用牛布魯菌外膜蛋白進(jìn)行更好的純化或挑選更加優(yōu)質(zhì)的抗原進(jìn)行研究。此外，本研究采用間接法制備的試紙條存在熒光信號偏弱的缺點(diǎn)，后續(xù)將制備抗OMP22的單克隆抗體和多克隆抗體，采用夾心法原理，提高熒光信號和試紙條檢測靈敏度。

總之，本研究以牛布魯菌外膜蛋白OMP22作為抗原，制備了診斷牛布魯菌病的熒光標(biāo)記免疫層析試紙條。該方法操作簡便，不需要特殊的儀器，不需要專業(yè)操作人員，且在短時(shí)間內(nèi)即可判斷結(jié)果，基本可以滿足基層獸醫(yī)單位或相關(guān)檢疫機(jī)構(gòu)快速檢測病原的要求，也為多種疾病聯(lián)檢試紙條的研制和多標(biāo)本快速定量檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。