李鵬

甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工學(xué)院 甘肅天水 741025

沙棘（Hippopphae rhamnoides L.）為胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木，在我國分布廣泛[1]。沙棘黃酮是沙棘主要藥用成分[2]，廣泛存在于沙棘果、葉、莖、根等不同器官中，具有清除超氧陰離子自由基及羥自由基、防癌抗癌[3]等作用，目前，沙棘加工企業(yè)在加工沙棘濃縮汁、沙棘果醬、沙棘油等產(chǎn)品，產(chǎn)生大量的沙棘果渣，而且研究表明沙棘果渣中黃酮的含量也相當(dāng)高[4]，若將沙棘果渣中黃酮提取并進(jìn)行體外抗氧化活性研究，以期為開發(fā)新的天然抗氧化劑和合理利用沙棘資源提供科學(xué)依據(jù)，對延伸沙棘加工產(chǎn)業(yè)鏈，提升沙棘開發(fā)利用的經(jīng)濟(jì)價值具有積極意義。

本研究利用甘肅天水地區(qū)沙棘果渣下腳料為原料，通過單因素及正交試驗方法對沙棘果渣黃酮進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，以確定最佳的工藝條件。同時，以VC為對照，對沙棘果渣黃酮提取液對羥自由基和超氧陰離子自由基清除效果進(jìn)行測定，評價其體外抗氧化活性的強(qiáng)弱。

1.材料與方法

1.1 儀器

紫外分光光度計；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；恒溫水浴鍋；數(shù)控超聲波清洗器；酒精計；電子天平；高速臺式離心機(jī)；數(shù)顯恒溫水浴鍋；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 材料與試劑 沙棘果渣（昌盛食品有限責(zé)任公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果渣黃酮的提取

取沙棘果渣2g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為60% 的乙醇30mL，60%功率超聲和一定時間提取類黃酮。提取液在20 ℃條件下8 000×g離心10 min，濾渣以同樣條件提取、離心、合并上清液，然后用乙醇溶液定容為100m L。

1.3.2 沙棘汁制備

總黃酮的測定方法

采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測定黃酮含量[5]。

取沙棘果渣提取液1 m L，置于25 m L量瓶中，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算質(zhì)量濃度，由質(zhì)量濃度計算沙棘果渣總黃酮提取率（%），按下式計算總黃酮提取率（%）。每個實驗在相同條件下提取3 個平行樣。

1.3.3 單因素實驗

乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%和80%共6個水平；料液比（g·mL-1）為l∶20、1∶30、l∶40、1∶50、1∶60和1∶70共6個水平；超聲波（超聲功率250 W)浸提時間為10、30、50、70、90 和110 min共6 個水平；提取次數(shù)為1、2、3 次和4次共4個水平，以沙棘果渣干粉為原料，分別進(jìn)行單因素試驗。

例如在教學(xué)《中國石拱橋》時，為了讓學(xué)生了解中國橋梁建設(shè)的光輝成就，在教學(xué)時，我們可以組織學(xué)生在閱讀文本后回答下面幾個問題，如：

1.3.4 正交實驗設(shè)計分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時間、提取次數(shù)，分別設(shè)計3個水平，以沙棘果渣為原料進(jìn)行正交試驗，每個試驗重復(fù)3次，確定沙棘果渣黃酮提取的最佳工藝條件。

1.3.5 沙棘果渣黃酮對羥自由基清除率的測定

將沙棘果渣黃酮提取液依次按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 和 1∶25 稀釋，得到不同質(zhì)量濃度的樣品醇溶物。精確吸取3 m L不同質(zhì)量濃度（0.509、0.768、0.914、1.691、3.318 mg·L-1 ）樣品醇溶物于試管中，依次向試管中加入2 m L 0.1 mol·L-1 FeSO4、2 m L 0.1 mol·L-1水楊酸、2 m L 0.1 mol·L-1 H2O2，用蒸餾水定容至10 m L并搖勻，在37 ℃條件下恒溫加熱30 min后在510 nm波長處測定其吸光度Aa；將體系中樣品用3 m L無水乙醇代替，在相同條件下測定其吸光度A0；將體系中H2O2用蒸餾水代替在相同條件下測定其吸光度Ab。用等質(zhì)量濃度的VC代替樣品做對照，按下式計算清除率（E）：

1.3.6 沙棘果渣黃酮對超氧陰離子自由基清除率的測定

取5支10 m L離心管各加入pH 8.2的50 m mol/L Tris-HC1緩沖液4.5 m L，再分別加入果渣提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L，然后依次加蒸餾水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 m L，混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 m L啟動反應(yīng)。5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 m L終止反應(yīng)。同時另取5支離心管，按上述步驟依次加入Tris-HCl緩沖液、黃酮提取液和蒸餾水，然后分別加10 m mol/L鹽酸溶液0.3 m L，5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 m L終止反應(yīng)，搖勻。在325 nm波長處檢測吸光度。按照下式計算沙棘果渣黃酮提取液對超氧陰離子自由基的清除率：

其中：A1為不含樣品的吸光度；A2為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度；A3為含樣品的吸光度；A4為含樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實驗設(shè)計分析

實驗結(jié)果表明，沙棘果渣黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時達(dá)到最大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到60%之后，沙棘果渣總黃酮提取量有所下降，在正交試驗中應(yīng)選擇50%～70%的乙醇作為優(yōu)化的參考范圍。

沙棘果渣黃酮提取量隨著料液比的增加而增加，料液比為1:20時達(dá)到最大值，當(dāng)料液比增加到1:40之后，其增加量對黃酮提取量的影響不大，料液比越大,溶劑用量越大，有利于黃酮的溶出，但當(dāng)達(dá)到最大的溶解度后黃酮類化合物基本提取完全，黃酮提取量不再增加，繼續(xù)增加料液比會造成溶劑和能源的浪費，因此在進(jìn)行正交試驗時，選擇1:20～1:40進(jìn)行優(yōu)化。

隨著提取時間的延長，黃酮提取率逐漸增加，且增幅明顯。當(dāng)浸提時間為50 min時，繼續(xù)延長浸提時間，提取率以較小的平緩幅度增加，考慮到浸提時間越長，能耗及經(jīng)濟(jì)成本越大，因此在進(jìn)行正交試驗時，選擇50～90 min進(jìn)行優(yōu)化。

沙棘果渣黃酮提取量隨著提取次數(shù)的增多而增加，提取次數(shù)為4次時達(dá)到最大值，當(dāng)提取次數(shù)為3次之后，沙棘果渣黃酮提取量緩慢增加，但對提取量的影響不大。

2.2 正交實驗設(shè)計分析

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)進(jìn)行正交實驗設(shè)計。按照 4因素 3 水平正交實驗進(jìn)行 9 次實驗，每次實驗平行3次。正交實驗分析結(jié)果見表1。

表1 沙棘果渣黃酮提取正交試驗結(jié)果與分析

由表1可知，沙棘果渣黃酮提取的最佳配比組合A1B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比(1:40)，提取時間為90 min，提取次數(shù)為3次。極差分析表明，提取次數(shù)對沙棘果渣黃酮提取的影響最大，各因素對沙棘酸奶感官品質(zhì)影響主次為提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)60%＞料液比＞提取時間。

2.3 沙棘果渣黃酮提取液抗氧化活性

2.3.1 沙棘果渣黃酮提取液清除羥自由基能力分析

圖1 沙棘果渣黃酮提取液和VC對羥自由基的清除能力

結(jié)果表明，沙棘果渣黃酮提取液和VC清除羥自由基的能力與質(zhì)量濃度呈上升趨勢，黃酮提取液和VC對羥自由基的清除率分別為41.37%～43.52%和36.95%～39.10%。沙棘果渣黃酮提取液質(zhì)量濃度為3.318 mg·L-1時，清除率達(dá)到43.52%，明顯大于同等質(zhì)量濃度VC的清除率39.10%。

2.3.2 沙棘果渣黃酮提取液清除超氧陰離子自由基能力分析

圖2 沙棘果渣黃酮提取液和VC對超氧陰離子自由基的清除能力

結(jié)果表明，沙棘果渣黃酮提取液和VC清除羥自由基的能力與質(zhì)量濃度呈上升趨勢。黃酮提取液和VC對超氧陰離子自由基的清除率分別為46.89%～58.75%和63.26%～85.67%，說明沙棘果渣黃酮提取液對超氧陰離子自由基有抑制作用，沙棘果渣黃酮提取液對超氧陰離子自由基的清除率明顯小于同等質(zhì)量濃度VC。同時，沙棘果渣黃酮提取液對超氧陰離子自由基的清除能力明顯大于對羥自由基的清除能力。

3.結(jié)論

采用超聲波輔助提取法對甘肅天水地區(qū)沙棘果渣黃酮進(jìn)行了提取，通過單因素試驗和正交試驗，得到影響黃酮提取率的提取因素的影響力大小為：提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間＞料液比。通過單因素試驗和正交試驗對沙棘果渣黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取條件為料液比為乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時間為90 min和，料液比為1:40，提取3次，在此優(yōu)化條件下，沙棘果渣總黃酮含量為3.157%。

通過自由基清除率測定實驗，表明沙棘果渣黃酮類化合物對生物體內(nèi)常見的2 種氧自由基都具有一定的清除作用，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，對自由基的清除能力也增強(qiáng)。研究結(jié)果還表明其對超氧陰離子自由基的清除作用強(qiáng)于對羥自由基的清除作用，這和已有的研究結(jié)果基本一致[9]。因此，甘肅天水地區(qū)沙棘果渣在抗氧化劑和功能食品的開發(fā)方面有良好的應(yīng)用前景，這將為利用沙棘進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類化合物提供理論依據(jù)。