朱依雯，凌曉靜，朱理想，魏繼福

過敏性疾病的發(fā)病率在全球持續(xù)上升，而豚草花粉被認為是引起過敏性疾病的重要原因之一。目前已知約40種豚草花粉，最常見的是矮豚草和三裂葉豚草。我國自我上報的過敏性鼻炎患者中，豚草致敏率達23.5%，甘肅地區(qū)519例支氣管哮喘患者中由豚草花粉引起者占11.75%(61/519)。目前國際免疫學會聯(lián)合會(International Union of Immunological Societies，IUIS)數(shù)據(jù)庫中豚草花粉過敏原主要來自矮豚草，而三裂葉豚草花粉報道較少。我國多地均有三裂葉豚草出現(xiàn)，對其致敏成分進行深入研究很有必要。

本研究旨在研究三裂葉豚草花粉新的致敏蛋白組分，為豐富三裂葉豚草過敏原組分的認識提供研究基礎(chǔ)，并探討其在中國人群中的致敏特征，進一步推動臨床過敏性疾病的診斷和治療。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR試劑盒、TA克隆試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒、pET- 28a質(zhì)粒載體限制性雙切酶、異丙基硫代半乳糖苷IPTG等(大連寶生物工程有限公司)；重組克隆試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司)；Anti-IgE——辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的羊抗人IgE(美國KPL公司)；四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)顯色液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ELISA終止液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；ECL顯影液和PVDF膜(Merck公司)。

1.2 方法

1.2.1 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶基因擴增與克?。恨D(zhuǎn)錄組測序由北京奧維森基因科技有限公司完成，將測序結(jié)果用基本局部比對算法搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)，與IUIS數(shù)據(jù)庫已知的花粉序列進行比對，找到一個潛在的超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)序列，并基于序列的非編碼區(qū)設(shè)計引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。并進行PCR擴增、TA克隆，將TA克隆結(jié)果送至南京擎科生物科技有限公司進行測序，將測序正確的菌進行后續(xù)的重組克隆。

1.2.2 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶序列比對：利用clustalX2序列比對工具將已報道蛋白類型屬于超氧歧化酶的序列(http：//www.allergen.org/)與三裂葉豚草花粉超氧歧化酶進行多重序列比對，分析氨基酸序列之間的保守性。使用MEGA7通過鄰接法(neighbor-joining法)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并分析其親緣關(guān)系。

1.2.3 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶表達和純化：提取測序正確的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL- 21感受態(tài)細胞中，加入IPTG誘導蛋白表達，通過SDS-PAGE凝膠電泳驗證成功誘導的菌株并進行大規(guī)模誘導培養(yǎng)。收集細菌并進行超聲裂解，通過SDS-PAGE凝膠電泳確定蛋白表達形式。采用Ni柱親和層析法對目的蛋白進行純化，并利用梯度透析法得到去除尿素的復性蛋白并再次進行電泳驗證。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)：將三裂葉豚草花粉超氧歧化酶重組蛋白稀釋至10 μg/mL，包被到96孔板中4 ℃過夜，并使用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)37 ℃封閉2 h。再加入1∶10稀釋于PBS- 0.1% Tween 20的豚草過敏患者血清100 μL/孔，37 ℃孵育2 h。用PBS- 0.1% Tween 20洗板后加入Anti-IgE，37 ℃孵育1 h，洗板后用TMB顯色液和ELISA終止液顯色并終止，450 nm處測吸光度。檢測結(jié)果使用GraphPad Prism 5作圖，Cut-off值為陰性對照組吸光度平均值加上3倍標準偏差。

1.2.5 免疫印跡實驗(Western blot)：10 μL純化后的三裂葉豚草花粉超氧歧化酶經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，再加入1∶10稀釋于PBS- 0.1% Tween 20 的ELISA陽性血清孵育過夜。PBS- 0.1% Tween 20洗滌后加入Anti-IgE，37 ℃下孵育1 h，最后用化學發(fā)光法檢測結(jié)合在三裂葉豚草花粉超氧歧化酶上的IgE。

2 結(jié)果

2.1 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶基因擴增與克隆

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物大小在500個堿基附近(圖1A)；對產(chǎn)物進行克隆和測序，三裂葉豚草花粉超氧歧化酶序列編碼區(qū)含有465個堿基，編碼154個氨基酸(圖1B)。

圖1 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶序列信息

2.2 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶序列比對與進化樹分析

根據(jù)clustalX2多重序列比對，三裂葉豚草花粉超氧歧化酶與橄欖花粉超氧歧化酶Ole e 5的氨基酸序列一致性最高，達53.9%(圖2A)。對三裂葉豚草花粉超氧歧化酶與其他來源的超氧歧化酶進行系統(tǒng)進化樹分析，三裂葉豚草花粉超氧歧化酶與橄欖花粉Ole e 5聚為一簇，自展值為100(圖2B)。

圖2 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶與其他物種同源過敏原多重序列比對與進化樹

2.3 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶表達和純化

三裂葉豚草花粉超氧歧化酶蛋白以包涵體形式在相對分子質(zhì)量16 000附近表達(圖3箭頭所示)。利用重組蛋白C-末端的組氨酸標記，在變性條件下采用Ni柱親和層析法對目的蛋白進行純化，并電泳驗證發(fā)現(xiàn)純化效果較好(圖3)。

圖3 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶表達純化

2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗與免疫印跡實驗

通過ELISA驗證三裂葉豚草花粉超氧歧化酶與豚草過敏患者血清中IgE結(jié)合活性，在42個豚草花粉過敏患者血清中有5個吸光度值大于Cut-off值，IgE結(jié)合率為12%(5/42)(圖4A)。利用免疫印跡實驗對其IgE結(jié)合活性進一步驗證，發(fā)現(xiàn)5個ELISA陽性患者血清均在免疫印跡中顯示出陽性結(jié)合條帶(圖4B)。

圖4 三裂葉豚草花粉超氧歧化酶免疫原性

3 討論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組學測序和蛋白組學研究，在三裂葉豚草花粉中發(fā)現(xiàn)一種新致敏蛋白組分超氧歧化酶。通過基因擴增、分子克隆和表達純化，獲得超氧歧化酶重組蛋白。最后通過ELISA和Western blot驗證該重組蛋白的免疫原性，其IgE結(jié)合率為12%(5/42)。

超氧歧化酶在生物系統(tǒng)中起著重要的作用，催化超氧化物(O)自由基的歧化生成HO和O。超氧歧化酶也是一種重要的致敏蛋白組分，Boluda等發(fā)現(xiàn)橄欖花粉中的超氧歧化酶是引起過敏性呼吸道疾病的重要原因，Crameri證明超氧歧化酶與煙曲霉相關(guān)肺部并發(fā)癥的發(fā)生具有一定的關(guān)聯(lián)，Wagner等利用大腸桿菌表達系統(tǒng)確認乳膠中的超氧歧化酶是一種重要的泛過敏原，瑞典學者也證實馬拉色菌中的超氧歧化酶與誘導特應(yīng)性濕疹/皮炎綜合征有關(guān)，伊朗學者在開心果中鑒定到一種重要的堅果致敏蛋白組分即超氧歧化酶，超氧歧化酶作為致敏蛋白組分在鏈格孢中也被發(fā)現(xiàn)。

IUIS數(shù)據(jù)庫中有多種類型的超氧歧化酶，它們之間的IgE結(jié)合率各有不同，如吸入性過敏原橄欖Ole e 5為35%(7/20)、接觸性過敏原皮膚真菌Mala s 11為75%(21/28)、食物性過敏原開心果Pis v 4為40%(10/25)等。多重序列比對發(fā)現(xiàn)三裂葉豚草花粉超氧歧化酶與橄欖Ole e 5氨基酸序列存在一定的保守性，但并不高。雖然系統(tǒng)進化樹顯示兩者親緣關(guān)系較近，但草本植物與木本植物物種間的跨度、氨基酸序列差異及地域差異最終表現(xiàn)為兩者IgE結(jié)合率的不同。另外，5份ELISA陽性血清在進一步的Western blot驗證下均顯示出陽性結(jié)合條帶，可能的原因是，不管構(gòu)象表位在空間結(jié)構(gòu)中是否遭到破壞，線性表位仍然貢獻了主要的IgE結(jié)合能力，但其空間結(jié)構(gòu)的特性仍需要探索。

三裂葉豚草花粉超氧歧化酶被證實是一種新的致敏蛋白組分，為三裂葉豚草花粉過敏患者的過敏原特異性免疫治療提供了信息并奠定了基礎(chǔ)，對臨床過敏性疾病的診斷和治療具有重要意義。