陳德森，胡熙耀，陳少秀，吳勝英*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 十堰 442000； 2.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)， 十堰 442000)

前列腺癌(prostatic cancer, CaP)指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，中老年男性是高危人群，在腫瘤發(fā)病率及死亡率中僅次于肺癌，占癌癥死亡的第二位，嚴重危害男性生命健康[1]。雄激素受體(androgen receptor，AR) 在雄性激素的代謝和發(fā)揮作用時起到重要作用，從生理角度來看，AR與雄性激素結(jié)合后可調(diào)控前列腺上皮細胞的生長、增殖和分泌，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中，AR發(fā)生磷酸化反應(yīng)是AR激活的重要途徑，因此，可以認為AR過表達是促進前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2]。張力蛋白同源第10號染色體缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN) 屬抑癌基因，PTEN基因缺失和AR過度表達都能引發(fā)前列腺癌的腫瘤細胞無限生長，且有研究表明，前列腺癌患者PTEN基因突變率顯著高于正常人[3-4]。目前，臨床上應(yīng)用最廣泛的前列腺腫瘤標志物為前列腺癌特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)，是前列腺癌診斷、鑒別診斷及療效監(jiān)測的重要參考指標[5]。在對前列腺癌原位移植瘤的研究中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷具有抑制前列腺癌細胞株的生長、遷移和侵襲的生物學(xué)活性[6-7]。但這一成果是針對細胞培養(yǎng)，而對在體動物方面鮮有報導(dǎo)，本實驗采用灌胃給藥的方法，研究淫羊藿苷對SCID小鼠前列腺癌原位移植瘤雄激素受體信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SCID小鼠 64只，5～6周齡，體質(zhì)量20.0～21.5 g，小鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院研究所提供[SCXK(鄂)2017-0031]，在十堰市太和醫(yī)院研究所清潔級動物房內(nèi)飼養(yǎng)[SYXK(鄂)2017-0031]。福利倫理審查證號：湖北醫(yī)藥學(xué)院動(福)第2018-1號。自然光照、恒溫20℃～22℃、恒濕60%～70%，自由飲用純凈水，喂養(yǎng)食料高壓滅菌處理。

1.2 主要試劑和儀器

淫羊藿苷(北京索萊寶科技有限公司，批號：0170203)；乙醚(廣州錢盛化工有限公司，批號：20161124)；人 LNCaP前列腺癌細胞株(上海酶研生物科技有限公司，批號：0712633-012)；PTEN、AR 檢測用RT-PCR試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號：0161024，0161029)；EDTA和RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基(上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，批號：)；胎牛血清(FBS)(賽默飛公司，批號：0161203)。

1.3 實驗方法

1.3.1 癌細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

將在液氮罐中凍存的人 LNCaP前列腺癌細胞株取出，37℃速融，然后倒入RPMI-1640培養(yǎng)液中復(fù)蘇24 h(培養(yǎng)箱通5%CO2、37℃怛溫)，每天換RPMI-1640培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)3 d。再用EDTA消化(0.25%)后收集足夠的人LNCaP前列腺癌細胞株，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成每毫升2×107個人LNCaP前列腺癌細胞的懸液，放入冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動物模型制備及成模標準

模型參考文獻方法[8]，采用乙醚吸入的方法麻醉小鼠，固定，于下腹部正中切開皮膚、分離腹膜，暴露膀胱，將小鼠膀胱向尾端翻轉(zhuǎn)，暴露生殖腺并用棉簽推向左右腹壁，找到膀胱頸處的左右 2 葉(葉狀肉紅色組織)前列腺腺體。將備用的人 LNCaP前列腺癌細胞株用微量注射器抽取50 μL注射于左右 2 葉前列腺腺體的背外側(cè)包膜內(nèi)(兩葉各25 μL)。注射后恢復(fù)臟器解剖位置，縫合創(chuàng)口，消毒，待小鼠清醒后放入隔離器內(nèi)觀察(單籠飼養(yǎng))。成模標準：本實驗在開展前的預(yù)實驗中，實驗人員采用以上方法，將10只小鼠前列腺注射人 LNCaP前列腺癌細胞株，發(fā)現(xiàn)全部小鼠的前列腺均有移植瘤生長，并廣泛地浸潤到膀胱、精囊等組織，形成固定的實質(zhì)性腫瘤包塊。其中100%(10/10)有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，80%出現(xiàn)(8/10)肺轉(zhuǎn)移，40%(4/10)出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，30%(3/10)出現(xiàn)脾轉(zhuǎn)移、20%(2/10)出現(xiàn)腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這一結(jié)果與多數(shù)文獻相符。在正式實驗中，處死的動物均與上述預(yù)實驗一致，全部建模的64只小鼠在摘取前列腺時均有本移植瘤生長并有廣泛的轉(zhuǎn)移，成瘤率達100%。

1.3.3 實驗動物分組

注射2周后將上述建模的64只小鼠編號，采用隨機數(shù)字表隨機均分為模型組、實驗A組、B組和C組。

1.3.4 治療方法

實驗A組、B組和C組于建模2周后分別按10 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg劑量灌胃給予淫羊藿苷，模型組給予生理鹽水對照。四組均于早晚各灌胃給予淫羊藿苷或生理鹽水各一次，連續(xù)治療 5周。

1.3.5 檢測指標和方法

四組于治療前和治療結(jié)束時各取8只小鼠，脫臼法處死，摘取前列腺，剝離前列腺瘤體背外側(cè)葉包膜，吸干、稱重、編號，分別測量長、短徑各3次，取3次的平均值為最終結(jié)果。腫瘤抑制率計算方法參照文獻[9]：實驗組腫瘤抑制率=(C-T)÷C×100%，其中T=實驗組平均瘤重；C=模型組平均瘤重。細胞周期采用流式細胞學(xué)方法檢測。取瘤組織剪碎，加入裂解液中沖打混勻，待其充分裂解后提取總RNA。采用RT-PCR檢測雄激素受體和張力蛋白同源第10號染色體缺失的磷酸酶基因表達，檢測時以β-ACTIN為內(nèi)參，采用Bio-Rad熒光實時定量PCR儀進行反應(yīng)并計算其相對表達量。采用Western blotting檢測前列腺癌特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)和磷酸化AR(p-AR)相對表達量(灰度值)，采用Quantity One軟件分析其灰度值[10]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組治療前后p-AR和PSA 相對表達量比較

模型組治療前后AR、p-AR組內(nèi)治療前后比較差異無顯著性(P>0.05)。實驗A組組內(nèi)治療前后比較差異無顯著性(P>0.05)。而實驗B組、C組治療后p-AR和 PSA低表達，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P<0.05)。(圖1)

注：與治療前比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05。

2.2 各組治療前后AR mRNA、PTEN mRNA蛋白相對表達量比較

模型組治療前后AR mRNA高表達，PTEN mRNA低表達，組內(nèi)治療前后比較差異無顯著性(P>0.05)。實驗A組組內(nèi)治療前后比較差異無顯著性(P> 0.05)。而實驗B組、C組治療后PTEN mRNA高表達，AR mRNA低表達，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P< 0.05)。

注：與治療前比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05。

2.3 淫羊藿苷對各組細胞周期的影響

流式細胞學(xué)方法檢測顯示， 模型組G0/G1比值較高，而S期較低，且治療前組間比較差異無顯著性(P> 0.05)，說明LNCaP前列腺癌細胞在G0/G1和S無序增殖，造模成功。治療后，實驗A組與模型組及組內(nèi)治療前比較差異無顯著性(P> 0.05)。實驗B組、C組治療后前列腺癌LNCaP細胞阻滯于S期，其G0/G1比值明顯降低，S期明顯提高，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P< 0.05)。(圖3)

注：與治療前比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05。

2.4 各組治療前后腫瘤細胞生長情況比較

四組治療前均有腫瘤生長，且治療前組間比較差異無顯著性(P> 0.05)，說明造模成功。模型組抑瘤率較低，瘤質(zhì)量和瘤體積組內(nèi)治療前后比較無顯著性(P> 0.05)。治療后，實驗A組與模型組及組內(nèi)治療前比較無顯著性(P>0.05)。實驗B組、C組治療后瘤質(zhì)量和瘤體積降低，抑瘤率提高，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P<0.05)。(表1)

表1 各組治療前后腫瘤細胞生長情況比較

注：與治療前比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note. Compared with before treatment,aP<0.05; Compared with model group,bP<0.05.

3 討論

淫羊藿(Epimedium brevicornu，Maxim)屬小檗科淫羊藿屬植物，又稱仙靈脾。淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、強健筋骨、補腎壯陽之功效。主治遺精早泄、腎虛陽痿、筋骨攣急、腎虛喘咳、腰膝酸軟、麻木拘攣、風(fēng)濕痹痛、四肢不仁、半身不遂、小淋瀝、喘咳及更年期高血壓等[11-12]。淫羊藿苷是從淫羊藿的全草中提取的黃酮類生物堿，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實其具有抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、促進成骨細胞生長及抑制破骨細胞活性等藥理作用[13-14]。在中藥治療前列腺癌方面的研究中，動物實驗發(fā)現(xiàn)淫羊藿素有雌激索樣恬性，可以抑制LNCaP細胞前列腺癌特異性抗原的轉(zhuǎn)錄并促進LNCaP細胞AR降解而發(fā)揮抑癌作用[15-16]。

研究表明，細胞S期和G0/G1與腫瘤增殖密切相關(guān)， S期和G0/G1周期紊亂是導(dǎo)致細胞分化、生長和凋亡失控的主因，可導(dǎo)致細胞無限制性分化、增殖、惡化和轉(zhuǎn)移[17]。由于惡性腫瘤生長的最基本生物學(xué)特征是腫瘤細胞失控性增殖(即細胞周期調(diào)控紊亂)，故在治療惡性腫瘤時應(yīng)將失控性增殖的腫瘤細胞阻滯在細胞S期和G0/G1、G2/M期[18]。AR為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，屬性激素受體，與雄激素結(jié)合后激活下游靶基因，保持前列腺干祖細胞的正常分化[19]。研究表明，大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展均存在組蛋白乙?；F(xiàn)象，正常前列腺干祖細胞內(nèi)AR的低表達，而低表達的AR可維持干祖細胞的干細胞特性并抑制該細胞的分化，AR在組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Tip60)及雄激素的刺激可誘導(dǎo)其乙酰化而增強其轉(zhuǎn)錄活性，促進AR的核轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致前列腺癌細胞增殖增強[20]。PTEN是繼p53后發(fā)現(xiàn)的較強的腫瘤抑制基因，具有磷酸化酶活性，與AR表達存在明顯的相關(guān)性，可通過阻止AR乙酰化而降低AR活性，從而發(fā)揮抑制列腺癌細胞生長、調(diào)控細胞周期和轉(zhuǎn)移的作用[21]。

在本研究中，模型組治療前后AR、p-AR、AR mRNA均高表達，PTEN mRNA低表達，說明采用人LNCaP前列腺癌細胞株懸液前列腺內(nèi)注射的方法建立前列腺癌原位移植瘤模型后，AR發(fā)生乙酰化現(xiàn)象，低表達的PTEN mRNA不能阻止AR乙酰化，LNCaP前列腺癌細胞在前列腺處于無序增殖。另外，模型組抑瘤率較低，瘤質(zhì)量和瘤體積組內(nèi)治療前后比較無顯著性。流式細胞學(xué)方法檢測顯示模型組G0/G1比值較高，而S期較低，且治療前組間比較無顯著性，說明LNCaP前列腺癌細胞在G0/G1和S無序增殖，提示造模成功。而實驗B組、C組治療后抑瘤率達(42.53±5.72，44.81±4.76)%，兩組AR mRNA、p-AR和 PSA低表達，PTEN mRNA高表達，且G0/G1期細胞比例降低、S期細胞比值升高，腫瘤細胞增殖被阻滯于S期，與治療前和模型組比較，差異有顯著性。這一結(jié)果與前面的研究結(jié)果一致。筆者分析認為，淫羊藿苷可能通過抑制AR乙酰化，提高PTEN合成而降低AR活性，從而發(fā)揮抑制列腺癌細胞生長、調(diào)控細胞周期和轉(zhuǎn)移效應(yīng)。因此，實驗B組、C組治療后，p-AR和 PSA低表達，說明治療有效。實驗B組、C組治療后G0/G1期細胞比例降低、S期細胞比值升高，提示腫瘤細胞增殖可能被阻滯于S期。

綜上所述，淫羊藿苷可明顯抑制LNCaP前列腺癌原位移植瘤的生長。眾所周知，前列腺癌具有雄性激素依賴性，而AR的乙?；强赡娴倪^程，推測淫羊藿苷可能通過調(diào)節(jié)雄激素受體信號通路來實現(xiàn)腫瘤生長抑制，在這個過程中，淫羊藿苷首先逆轉(zhuǎn)AR乙?；?，使AR去乙酰化并降低其活性，進一步減少與雄性激素結(jié)合，降低前列腺癌細胞生長必需的激素基礎(chǔ)，同時提高抑癌基因PTEN，高水平的PTEN 可增強磷酸化酶活性而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用。本實驗結(jié)果表明，淫羊藿苷可使失控性增殖的腫瘤細胞阻滯在S期，這為淫羊藿苷應(yīng)用于臨床治療前列腺癌提供了理論參考。