羅飛亞，馮克然，張露勇，胡培麗，邢書(shū)霞，王鋼力

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

皮膚腐蝕性是化學(xué)品及化妝品安全管理中一項(xiàng)較為重要的毒理學(xué)終點(diǎn)，隨著動(dòng)物福利“3R”(減少Reduction、優(yōu)化Refinement、替代Replacement)原則的提出，在毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域中，替代檢測(cè)技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注[1-3]。OECD指南批準(zhǔn)的皮膚腐蝕性替代試驗(yàn)僅有3類(lèi)，包括大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)(transcutaneous electrical resistance test method，TER)[4]，體外皮膚刺激性/腐蝕性的重組人表皮模型試驗(yàn)(RHE)[5-6]和體外皮膚腐蝕性膜屏障試驗(yàn)[7]。其中TER是利用大鼠背部離體皮膚檢測(cè)腐蝕性，與傳統(tǒng)的家兔試驗(yàn)相比[8]，TER減少動(dòng)物數(shù)量、減輕動(dòng)物痛苦，符合“3R”原則[9-10]。OECD指南中推薦使用Wistar大鼠或其他類(lèi)似品系的大鼠，考慮SD大鼠是較為常用的研究皮膚病理相關(guān)的大鼠品系[11-12]，而SD大鼠又是由Wistar大鼠育種而來(lái)，但兩種品系已存在遺傳學(xué)差異[13]。因此，本研究通過(guò)對(duì)比SD大鼠與Wistar大鼠的經(jīng)皮電阻腐蝕性測(cè)試結(jié)果，從而為大鼠經(jīng)皮電阻測(cè)試選擇合適的大鼠品系提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar種大鼠，鼠齡18～21 d，體重60～80 g；SPF級(jí)SD大鼠，鼠齡18～21 d，體重80～100 g，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心提供【SCXK(京)2014-0013】。動(dòng)物試驗(yàn)環(huán)境條件為屏障環(huán)境【SYXK(京)2016-0004】，溫度22℃～24℃，相對(duì)濕度50%～70%，動(dòng)物自由飲食，日光燈12 h照明。大鼠皮膚應(yīng)健康無(wú)破損，試驗(yàn)前動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng)3 d后，剃去背部和兩側(cè)被毛，間隔3 d以含抗生素溶液浸洗去毛區(qū)2次。

1.2 試劑與儀器

選擇《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)中推薦的12種參考物質(zhì)作為受試物：4-氨基-1,2,4-三氮唑(TCI)、丁子香酚(國(guó)藥集團(tuán)北京分公司)、溴乙基苯(Alorich)、四氯乙烯(國(guó)藥集團(tuán)北京分公司)、異硬脂酸(Adamas)、4-甲硫基-苯甲醛(TIC)、N,N-二甲基亞二丙基三胺(Adamas)、鄰叔丁基苯酚(TCI)、氫氧化鉀(10% w/v，國(guó)藥集團(tuán)北京分公司)、硫酸(10% w/v，國(guó)藥集團(tuán)北京分公司)、辛酸(國(guó)藥集團(tuán)北京分公司)、1,2-丙二胺(國(guó)藥集團(tuán)北京分公司)。以鹽酸(10 mol/L)作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照。電解液(154 nmol/L MgSO4)、羅丹明B染料(10% w/v SRB)、染料萃取液(30% w/v SDS)。

大鼠經(jīng)皮電阻儀由北京華清天禧醫(yī)藥科技有限公司提供，儀器參數(shù)符合OECD指南及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)[12]要求(工作電壓220 V，50 Hz，交流電，工作電極為2根216惰性銀電極)，皮膚固定裝置選用聚四氟乙烯參照OECD指南裝置示意圖及尺寸要求制作[5,14]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠經(jīng)皮電阻儀24 h穩(wěn)定性

分別選取同一只Wistar大鼠或SD大鼠(29 d)背部靠近脊柱兩側(cè)的皮膚，制成直徑約20 mm的小皮片5～6塊，連續(xù)觀(guān)察24 h內(nèi)分別選取不同時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、20、22、23和24 h)，讀取大鼠經(jīng)皮電阻值(TER)，重復(fù)試驗(yàn)3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3.2 大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)

依照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)[14]的描述(與OECD指南操作一致)，大鼠于第29天時(shí)處死(大鼠處死時(shí)間必須在第28～30天內(nèi))，剪取去毛區(qū)皮膚，剔除皮下脂肪，表皮面向上固定于聚四氟乙烯管上，剪去多余皮膚，以液體石蠟封口。試驗(yàn)前向管內(nèi)加入1 mL電解液(154 mmol/L硫酸鎂溶液)，接上電極測(cè)定TER值，大于20 kΩ者可用。

液體受試物原液150 μL直接加入管內(nèi)皮片的表皮面；固體受試物先研磨成細(xì)粉，取約100 mg撒在皮片表面，再加150 μL去離子水潤(rùn)濕以增加受試物與表皮的接觸。加樣后室溫靜置24 h，以流水輕柔地沖洗皮片表皮面，用洗瓶向表皮面滴加足量70%的乙醇，5 s后去除乙醇，再以流水清洗。盡量除凈受試物后，向管內(nèi)加入1 mL電解液，接上電極測(cè)定TER值。記錄TER值后，去除管中的電解液，肉眼檢查并紀(jì)錄皮片的損傷情況。

1.3.3 羅丹明B(SRB)染料滲透量測(cè)定

向管內(nèi)皮片表皮面滴加150 μL羅丹明B染料(10% SRB水溶液)，室溫靜置2 h，以流水輕柔的沖洗管壁，去除多余的SRB，并將皮片取下，放入含8 mL雙蒸水的離心管中震搖5 min，換干凈的雙蒸水重復(fù)清洗1次。將皮片放入5 mL萃取液(30% SDS水溶液)中，60℃水浴提取過(guò)夜，去除皮片，剩余提取液以1900 r/min離心8 min，取上清液1 mL加4 mL萃取液稀釋至5 mL，測(cè)吸光度值(OD值為565 nm)。

1.3.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)方案

OECD判定程序[4]：按OECD TG430的判定程序，TER>5 kΩ為非腐蝕性(NC)；對(duì)于TER≤5 kΩ且肉眼觀(guān)察皮片有明顯損傷判為腐蝕性(C)；TER≤5 kΩ且肉眼觀(guān)察皮片沒(méi)有明顯損傷的進(jìn)行染料滲透量測(cè)定；染料滲透量大于或等于10 mol/L鹽酸的為C，染料滲透量小于10 mol/L鹽酸的為NC。

注：E1-3分別為3次24 h穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)曲線(xiàn)。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[14]判定程序：TER>15 kΩ為NC，TER<5 kΩ且肉眼觀(guān)察皮片有明顯損傷判定為C；TER為5 ～15 kΩ且肉眼觀(guān)察皮片未見(jiàn)明顯損傷的，或3個(gè)平行樣的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波動(dòng)的或肉眼可見(jiàn)皮片明顯破損、變色、變硬等可疑情況，需進(jìn)行染料滲透量測(cè)定，染料滲透量大于或等于10 mol/L鹽酸的為C，染料滲透量小于10 mol/L鹽酸的為NC。

為同時(shí)兼顧OECD和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》的判定程序，實(shí)際上在試驗(yàn)中，除TER>15 kΩ，且肉眼觀(guān)察皮片無(wú)損傷的受試物組外，其余組別的皮片均進(jìn)行了羅丹明B染色的步驟。

2 結(jié)果

2.1 大鼠經(jīng)皮電阻儀24 h儀器穩(wěn)定性結(jié)果

大鼠皮片TER值變化如圖1所示，在皮片置于皮膚固定裝置后，TER值呈降低趨勢(shì)，24 h后穩(wěn)定在20～30 kΩ。兩種大鼠皮片TER值3次重復(fù)試驗(yàn)的變化趨勢(shì)一致。

2.2 TER腐蝕性結(jié)果判定及真實(shí)性分析

采用TER方法對(duì)12種參考物質(zhì)進(jìn)行腐蝕性檢測(cè)，綜合考慮TER值、羅丹明B染料滲透量和肉眼觀(guān)察皮片損傷結(jié)果，并分別用OECD指南[4]和我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[14]的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，結(jié)果如表1和表2所示。Wistar和SD大鼠檢測(cè)陰性對(duì)照(雙蒸水)TER平均值分別為18.36 kΩ和24.35 kΩ，符合OECD指南和安全技術(shù)規(guī)范中的參考數(shù)據(jù)(10～25 kΩ)，陽(yáng)性對(duì)照10 mol/L鹽酸的TER平均值分別3.93 kΩ和3.81 kΩ，均略高于OECD指南和安全技術(shù)規(guī)范的參考數(shù)據(jù)(0.5～1.0 kΩ)。

以O(shè)ECD指南判定標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果顯示，N,N-二甲基亞二丙基三胺、10%氫氧化鉀和辛酸在Wistar和SD大鼠的檢測(cè)結(jié)果中均呈現(xiàn)假陰性；以《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》的判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果顯示，4-甲硫基-苯甲醛以Wistar大鼠檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性，以SD大鼠檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性。

2.3 兩品系大鼠結(jié)果比較

將兩品系大鼠用兩種方案判定的結(jié)果進(jìn)行方法真實(shí)性分析，并與這12種參考物質(zhì)的實(shí)際皮膚腐蝕性數(shù)據(jù)[15]進(jìn)行χ2檢驗(yàn)對(duì)比(表3)，發(fā)現(xiàn)兩品系大鼠使用OECD指南判定腐蝕性結(jié)果一致，靈敏性50%，特異性100%；兩品系大鼠使用安全技術(shù)規(guī)范判定的結(jié)果中，以SD大鼠效能最高，特異性和敏感性均達(dá)到100%，Wistar大鼠靈敏性100%，特異性83.3%。兩品系大鼠使用OECD指南和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》判定結(jié)果均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

兩品系大鼠對(duì)同一個(gè)物質(zhì)腐蝕性判定的結(jié)果基本一致，除Wistar大鼠以安全技術(shù)規(guī)范方法判定4-甲硫基-苯甲醛為腐蝕性(假陽(yáng)性)而SD大鼠判定為非腐蝕性外，其余物質(zhì)的判定結(jié)論均一致。經(jīng)對(duì)比，兩品系大鼠采用同一種判定標(biāo)準(zhǔn)判定的腐蝕性結(jié)果沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠的TER讀數(shù)整體偏低，皮片初始的電阻值偏小，棄用的情況較多。綜上，在本實(shí)驗(yàn)條件下，推薦使用SD大鼠進(jìn)行經(jīng)皮電阻試驗(yàn)。

表1 Wistar大鼠腐蝕性測(cè)試結(jié)果

注：1：C：腐蝕性；NC：非腐蝕性；各受試物經(jīng)皮腐蝕性為UN GHS目錄中基于體內(nèi)數(shù)據(jù)判定的結(jié)果[15]。2：No：未觀(guān)察到皮片損傷；Yes：觀(guān)察到皮片損傷。Note.1:C: Corrosion; NC: None corrosion; the corrosion were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults[15].2: No：There is no obvious damage on skin disc; Yes：There is obvious damage on skin disc。

表2 SD大鼠腐蝕性測(cè)試結(jié)果

注：1：C：腐蝕性；NC：非腐蝕性；各受試物經(jīng)皮腐蝕性為UN GHS目錄中基于體內(nèi)數(shù)據(jù)判定的結(jié)果[15]。2：No：未觀(guān)察到皮片損傷；Yes：觀(guān)察到皮片損傷。Note.1:C: Corrosion; NC: None corrosion; the corrosion were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults[15].2: No: There is no obvious damage on skin disc;Yes: There is obvious damage on skin disc。

表3 兩品系大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)結(jié)果各判定方案的真實(shí)性指標(biāo)分析(n=6，%)

注*: 所有結(jié)果與各受試物參考腐蝕性數(shù)據(jù)[15]進(jìn)行比對(duì)。

Note.*. All results compared with the reference corrosive parameters of the tested substance.

3 討論

OECD指南[4]和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[14]方法中對(duì)試驗(yàn)是否進(jìn)行第二步羅丹明B染色步驟的要求略有不同：OECD是以5 kΩ為界值，只要檢測(cè)獲得的TER值大于5 kΩ，且肉眼觀(guān)察皮片無(wú)損傷，則不需要經(jīng)過(guò)染色直接判定為非腐蝕性；而安全技術(shù)規(guī)范中要求在TER值為5 ～15 kΩ且肉眼觀(guān)察皮片未見(jiàn)明顯損傷的，或3個(gè)平行樣的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波動(dòng)的或肉眼可見(jiàn)皮片明顯破損、變色、變硬等可疑情況，均需進(jìn)行染色步驟的判定。本研究中，兩品系大鼠均表現(xiàn)為使用化妝品安全技術(shù)規(guī)范判定時(shí)方法效能更高，說(shuō)明進(jìn)行羅丹明B染色可有效地提高對(duì)皮膚腐蝕性判定的準(zhǔn)確性。

TER方法腐蝕性判定界值與研究所使用的大鼠經(jīng)皮電阻儀性能相關(guān)[16]，不同的大鼠經(jīng)皮電阻儀其判定界值可能會(huì)改變，這點(diǎn)與OECD指南[4]中指出的“如采用新的儀器檢測(cè)，可能會(huì)改變判定界值，需要進(jìn)一步驗(yàn)證”的描述一致。本研究中所使用的大鼠經(jīng)皮電阻儀是配合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》方案設(shè)計(jì)，因此使用安全技術(shù)規(guī)范的方案判定效能更高。

OECD指南及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中均推薦使用Wistar大鼠，但原文中也說(shuō)可以使用其他類(lèi)似品系的大鼠。SD大鼠自1925年由Wistar大鼠培育而成[13]，廣泛應(yīng)用于皮膚腫瘤、皮膚科藥物、皮膚病理等方面的研究，結(jié)合本研究的數(shù)據(jù)認(rèn)為，SD大鼠可代替Wistar大鼠進(jìn)行TER檢測(cè)，符合OECD指南及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》對(duì)動(dòng)物品系的要求。