馮 潔，謝建云，魏曉鋒，馮麗萍，張 泉，高 誠(chéng)*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海 201203)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)質(zhì)量是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行微生物質(zhì)量監(jiān)測(cè)是確保動(dòng)物質(zhì)量的重要手段。歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聯(lián)合會(huì)(FELASA)定期發(fā)布和更新詳細(xì)全面的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)控指南和人員培訓(xùn)計(jì)劃，詳細(xì)闡述了監(jiān)測(cè)病原體的種類(lèi)、采樣要求和檢測(cè)方法等[1]。國(guó)際知名的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物企業(yè)(如CRL、Taconic)均制定一系列企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)制度，對(duì)于病原體項(xiàng)目、動(dòng)物年齡、檢測(cè)方法和頻率均有明確指示。我國(guó)于1994年頒布了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)》并陸續(xù)進(jìn)行了修改和完善，按照微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)規(guī)定了不同等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)排除的病原體及對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法。2017年以來(lái)中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)制定并發(fā)布兩批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，新增了部分病原體項(xiàng)目及檢測(cè)方法，對(duì)于我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量保證和提升起到了促進(jìn)作用。本研究在詳細(xì)比較國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌監(jiān)測(cè)方案并結(jié)合實(shí)際的基礎(chǔ)上，選取國(guó)外普遍要求檢測(cè)而我國(guó)國(guó)標(biāo)暫未納入(螺桿菌、嚙齒檸檬酸桿菌、牛棒狀桿菌)以及國(guó)標(biāo)規(guī)定檢測(cè)(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌)的細(xì)菌指標(biāo)作為調(diào)查項(xiàng)目，采用PCR方法對(duì)2014年和2016年上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證單位實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠的部分細(xì)菌攜帶狀況進(jìn)行調(diào)查。調(diào)查結(jié)果可為上海乃至全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制提供參考，也可為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的修訂和完善提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本次調(diào)查的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括小鼠和大鼠，來(lái)源于2014年和2016年上海市具有實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠生產(chǎn)許可證的單位。清潔級(jí)和SPF級(jí)動(dòng)物均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境。各年度檢測(cè)設(shè)施數(shù)量、動(dòng)物數(shù)量及品系分布詳見(jiàn)表1和表2。

表1 不同年份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)設(shè)施、動(dòng)物數(shù)量統(tǒng)計(jì)表

表2 動(dòng)物品系分布表

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶、2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)、DL2000 plus DNA Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

無(wú)菌采集動(dòng)物回盲部?jī)?nèi)容物，取0.2 g懸浮于1 mL的PBS(pH7.4)，850 r/min離心5 min后取上清液，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA模板抽提。獲得的DNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR引物序列

參照文獻(xiàn)[2-5]，根據(jù)GenBank登錄的牛棒狀桿菌16S rRNA序列(NR_118465.1)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見(jiàn)表3。

表3 PCR引物列表

1.3.3 PCR反應(yīng)程序

PCR反應(yīng)體系50 μL，包括2× Taq Plus Master Mix(Dye Plus)25 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，DNA模板2 μL。

PCR反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性5 min后，按95°C 變性30 s，退火30 s，72°C 延伸30 s的程序循環(huán)34次，最后72°C 延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。將不同來(lái)源的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行歸類(lèi)，隨機(jī)挑選陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化回收后送至至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)、驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 設(shè)施分析

如圖1所示， 在SPF級(jí)設(shè)施未檢出金黃色葡萄球菌污染，清潔級(jí)設(shè)施2014年未檢出肺炎克雷伯桿菌污染，其它病原體在不同級(jí)別設(shè)施內(nèi)均有不同程度的污染。所有清潔級(jí)設(shè)施均存在螺桿菌和牛棒狀桿菌污染，SPF級(jí)設(shè)施的螺桿菌和牛棒狀桿菌污染率分別為77.78%(2014年)、61.54%(2016年)和66.67%(2014年)、92.31%(2016年)。

圖1 不同細(xì)菌檢測(cè)項(xiàng)目的設(shè)施污染率比較

2.2 病原檢測(cè)結(jié)果分析

如圖2所示，大鼠螺桿菌陽(yáng)性率為34.26%(2014年)和25.64%(2016年)，嚙齒檸檬酸桿菌陽(yáng)性率為4.63%(2014年)和17.95%(2016年)，牛棒狀桿菌陽(yáng)性率為23.15%(2014年)和33.33%(2016年)，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性率為5.56%(2014年)和7.69%(2016年)，綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌均未檢出陽(yáng)性。小鼠螺桿菌陽(yáng)性率為40.39%(2014年)和29.73%(2016年)，嚙齒檸檬酸桿菌陽(yáng)性率為5.88%(2014年)和15.48%(2016年)，牛棒狀桿菌陽(yáng)性率為19.22%(2014年)和38.33%(2016年)，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性率為1.57%(2014年)和0%(2016年)，綠膿桿菌陽(yáng)性率為9.80%(2014年)和0.74%(2016年)，肺炎克雷伯桿菌陽(yáng)性率(2014年0.78%，2016年3.69%)。

分別對(duì)不同級(jí)別動(dòng)物不同年份的陽(yáng)性率進(jìn)行分析。如表4所示，螺桿菌僅清潔級(jí)大鼠陽(yáng)性率呈上升趨勢(shì)，其他級(jí)別均下降。嚙齒檸檬酸桿菌和牛棒狀桿菌在不同級(jí)別動(dòng)物上的陽(yáng)性率均呈上升趨勢(shì)。國(guó)標(biāo)要求排除的3種細(xì)菌，金黃色葡萄球菌僅清潔級(jí)有陽(yáng)性檢出，SPF級(jí)均為陰性，符合國(guó)標(biāo)要求。大鼠綠膿桿菌無(wú)陽(yáng)性檢出，不同年份、不同級(jí)別的小鼠均有陽(yáng)性檢出，但均呈下降趨勢(shì)。大鼠肺炎克雷伯桿菌無(wú)陽(yáng)性檢出，小鼠僅2014年清潔級(jí)為陰性，其他均有陽(yáng)性檢出。

對(duì)陽(yáng)性動(dòng)物品系進(jìn)行分析，螺桿菌陽(yáng)性率相對(duì)較高的品系有BALB/c、ICR、KM等，僅KM陽(yáng)性率升高，其它品系陽(yáng)性率均下降。來(lái)自同一設(shè)施的22只清潔級(jí)F1小鼠螺桿菌全部為陽(yáng)性。所有品系動(dòng)物均檢出牛棒狀桿菌陽(yáng)性。大多數(shù)品系的嚙齒檸檬酸桿菌和牛棒狀桿菌陽(yáng)性率均呈升高趨勢(shì)。金黃色葡萄球菌僅SD大鼠和BALB/c小鼠檢出陽(yáng)性。綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌陽(yáng)性樣品均集中在小鼠。在動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用過(guò)程中應(yīng)加以關(guān)注(表5,表6)。

圖2 PCR檢測(cè)不同動(dòng)物陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

表4 PCR檢測(cè)不同級(jí)別動(dòng)物陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)(%)

表5 PCR檢測(cè)不同品系動(dòng)物陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)(%，2014年)

表6 PCR檢測(cè)不同品系動(dòng)物陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)(%，2016年)

3 討論

細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)方法可分為傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)以及PCR等分子生物學(xué)方法。當(dāng)前國(guó)際先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)已廣泛使用PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)制定的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中亦發(fā)布了部分病原體(如螺桿菌、牛棒狀桿菌)的PCR檢測(cè)規(guī)程。但我國(guó)國(guó)標(biāo)目前主要采用分離培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，尚未采用分子生物學(xué)方法。培養(yǎng)法需要培養(yǎng)基配制、采樣、分離培養(yǎng)、染色鏡檢和生化鑒定等多個(gè)環(huán)節(jié)，存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作流程繁瑣、檢測(cè)試劑的供應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)化不足、對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)技術(shù)要求較高等諸多不足，嚴(yán)重制約了我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)體系的完善與發(fā)展。PCR方法相較于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法特異性強(qiáng)，敏感性高。在規(guī)范試驗(yàn)試劑、設(shè)備以及人員操作流程的前提下，可用于病原體的快速檢測(cè)，尤其適用于大規(guī)模篩查。

國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)中普遍要求實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠須排除的病原體，如螺桿菌、牛棒狀桿菌、檸檬酸桿菌等均未出現(xiàn)在我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中。螺桿菌主要以隱性感染形式存在于動(dòng)物消化道，可致小鼠肝炎、肝細(xì)胞瘤、盲腸結(jié)腸炎、膽肝炎等多種疾病，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，已被公認(rèn)為是嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要致病菌。嚙齒檸檬酸桿菌為腸桿菌科檸檬酸桿菌屬成員之一，為條件性致病菌，可引起小鼠傳染性結(jié)腸增生、腹瀉、結(jié)腸炎甚至直腸脫垂等癥狀。對(duì)于免疫功能健全的成年小鼠，一般無(wú)明顯癥狀。牛棒狀桿菌可導(dǎo)致裸鼠表皮角化過(guò)度，俗稱“鱗皮病”。無(wú)毛鼠和免疫缺陷鼠一旦感染，幾乎終身攜帶。動(dòng)物感染通常伴隨體重減輕、攝水量增加、結(jié)膜充血、異種移植物生長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象，設(shè)施一旦污染很難清除[6]。金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌是我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(14922.2-2011)中明確規(guī)定SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠必須檢測(cè)和排除的病原菌[7]，均屬于條件性致病菌，正常存在于動(dòng)物體內(nèi)和環(huán)境中，當(dāng)動(dòng)物免疫功能低下時(shí)可感染動(dòng)物。國(guó)外多數(shù)將其作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的參考指標(biāo)，當(dāng)評(píng)估認(rèn)為該病原體可能會(huì)對(duì)正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)存在干擾時(shí)則要求監(jiān)測(cè)。

本研究參照文獻(xiàn)所述PCR檢測(cè)程序，對(duì)上海地區(qū)實(shí)驗(yàn)鼠群進(jìn)行大規(guī)模質(zhì)量監(jiān)測(cè)，并從設(shè)施、動(dòng)物級(jí)別、動(dòng)物品系等多角度全面系統(tǒng)地分析了當(dāng)前實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠細(xì)菌的攜帶狀況。數(shù)據(jù)顯示，螺桿菌、嚙齒檸檬酸桿菌和牛棒狀桿菌在不同級(jí)別動(dòng)物上均有陽(yáng)性檢出。尤其是清潔級(jí)小鼠螺桿菌、所有級(jí)別動(dòng)物的牛棒狀桿菌和檸檬酸桿菌污染率高、污染范圍廣，應(yīng)引起重視。嚙齒檸檬酸桿菌、牛棒狀桿菌、肺炎克雷伯桿菌陽(yáng)性率呈明顯上升趨勢(shì)，但螺桿菌、綠膿桿菌陽(yáng)性率均呈下降趨勢(shì)。文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示，螺桿菌呈全球性分布，Charles River對(duì)北美和歐洲實(shí)驗(yàn)鼠群螺桿菌進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，螺桿菌是實(shí)驗(yàn)鼠群主要流行的病原體。金黃色葡萄球菌是日本實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠流行最普遍的病原體，小鼠設(shè)施陽(yáng)性率達(dá)18.8%，大鼠設(shè)施陽(yáng)性率達(dá)58.62%，歐美小鼠金黃色葡萄球菌的攜帶率為6%～11%，嚙齒檸檬酸桿菌感染率極低[8-10]。我國(guó)北京、廣東等地區(qū)也有螺桿菌、牛棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌陽(yáng)性報(bào)道[11-14]。由此可見(jiàn)，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)鼠群病原體污染的流行趨勢(shì)基本一致。

雖然PCR方法具備精準(zhǔn)、高效、便捷的優(yōu)勢(shì)，仍需結(jié)合經(jīng)典方法進(jìn)行驗(yàn)證。筆者認(rèn)為后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步溯源至陽(yáng)性的設(shè)施和品系，開(kāi)展細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定等病原學(xué)方面的工作，以全面細(xì)致了解本市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)設(shè)施內(nèi)上述細(xì)菌的分布情況。本研究的調(diào)查結(jié)果對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和飼養(yǎng)管理水平起促進(jìn)作用，為我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的修訂和完善提供依據(jù)和參考。鑒于上述病原體對(duì)于動(dòng)物本身及從業(yè)人員和環(huán)境的影響，生產(chǎn)單位作為國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的源頭，應(yīng)結(jié)合行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，制定并優(yōu)化監(jiān)測(cè)方案，從而提高動(dòng)物品質(zhì)和企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力。