鄧俊成，蘇小華，呂 明，王 超，顧為望,*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)， 東莞 523808； 3.東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司， 東莞 523808)

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，表現(xiàn)為胰島素分泌不足或作用缺陷引起的代謝紊亂。有調(diào)查顯示，我國成人糖尿病的患病率估計(jì)為10.9%，糖尿病前期的流行率估計(jì)為35.7%[1]。目前，還沒有能根治糖尿病的方法，只能通過多種手段對(duì)糖尿病的病情進(jìn)行控制。小型豬由于在代謝機(jī)制、糖類吸收和利用、胰腺發(fā)育和形態(tài)等方面與人類的極其相似[2]，而且豬的胰島素只有一個(gè)氨基酸與人的不同，因此非常適合作為研究糖尿病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?，F(xiàn)在用于制作小型豬糖尿病模型的主要方法有STZ法、飲食誘導(dǎo)法或者以上兩者結(jié)合的方法，但造模過程較為繁瑣。在實(shí)驗(yàn)小型豬的培育過程中，本課題組篩選出一頭有高血糖表現(xiàn)的巴馬小型豬公豬2907，用這頭公豬作為種公豬，以近親交配的方式組建家系，至今已培育至F 5代。本研究旨在對(duì)正常巴馬小型豬和高血糖家系F 5代個(gè)體的血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行比較和分析。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

巴馬小型豬20頭，普通級(jí)，雌雄各半,體重15～20 kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：【SCXK(粵)2017-0030】。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)在該公司的普通級(jí)實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，使用許可證號(hào)：【SYXK(粵)2017-0123】。巴馬小型豬在同樣的環(huán)境下飼養(yǎng)，日常飼喂按日糧4%體重的標(biāo)準(zhǔn)提供，分別在每天8:00～9:00和16：00～17：00兩次飼喂，自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

豬胰島素ELISA試劑盒(CSB-E06828p)、豬胰高血糖素ELISA試劑盒(CSB-E04854p)、豬糖化血紅蛋白ELISA試劑盒(CSB-E17546p)，武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品。

血糖儀(強(qiáng)生 穩(wěn)豪倍易型)，血糖試紙(強(qiáng)生 穩(wěn)豪型)，低溫高速離心機(jī)(eppendorf 5810 R)，酶標(biāo)儀(Thermo FC)，血液分析儀(sysmex XT-1800 i)，生化分析儀(OLYMPUS AU 2700)，臺(tái)式小型離心機(jī)(eppendorf 5418)，電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司 HWS 12型)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

選取高血糖家系的F5代巴馬小型豬10頭和普通正常的巴馬小型豬10頭，分別作為高血糖家系組和普通正常組，在6月齡時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前禁食16 h，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早上8點(diǎn)在空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 空腹血糖和餐后2 h血糖檢測(cè)

通過前腔靜脈采集新鮮血液，使用血糖儀對(duì)新鮮靜脈血進(jìn)行空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)測(cè)定。餐后2 h血糖(2 hour postprandial glucose，2 hPG)于進(jìn)食第一口計(jì)時(shí)，于2小時(shí)后從前腔靜脈采集血液，用血糖儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)(intravenous glucose tolerance test，IVGTT)

先對(duì)巴馬小型豬的體重進(jìn)行稱量，再從耳緣靜脈注射50%的葡萄糖注射液，注射量為1.2 mL/kg，4 min內(nèi)推注完[3]，在注射完葡萄糖后的第0、10、30、60和120分鐘從前腔靜脈采血，用血糖儀測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)的血糖值。

1.3.4 糖代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

采集血液經(jīng)離心處理后，用于檢測(cè)糖代謝相關(guān)指標(biāo)。采用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)如下指標(biāo)：胰島素(insulin，INS)、胰高血糖素(glucagon，GC)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)。

1.3.5 胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算

根據(jù)空腹血糖和空腹胰島素計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)：胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.3.6 血液生理生化指標(biāo)檢測(cè)

EDTA-K2抗凝采血管采集的血液直接用于血液生理指標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)如下：白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細(xì)胞比容(hematocrit，HCT)、紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、血小板(platelets，PLT)、紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width-standard deviation，RDW-SD)、紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width-coefficient of variation，RDW-CV)、中性粒細(xì)胞(neutrophil，NEUT)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte，LYMPH)、單核細(xì)胞(monocytes，MONO)、嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EO)、嗜堿性粒細(xì)胞(basophil，BASO)。普通采血管采集的血液分離的血清用于血液生化指標(biāo)檢測(cè)，血液生化檢測(cè)指標(biāo)如下：總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLO)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-CH)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-CH)、甘油三酯(triglyceride，TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高血糖家系F5代系譜

經(jīng)過長(zhǎng)期的檢測(cè)，家系種公豬2907的空腹血糖維持在6.0 mmol/L以上，而同一環(huán)境下的普通正常巴馬小型豬的空腹血糖水平為2.0～3.5 mmol/L。應(yīng)用此高血糖公豬組建家系，挑選空腹血糖在5.0 mmol/L的子代作為選育對(duì)象，現(xiàn)在已經(jīng)選育到F5代(圖1)。從F 3代開始表現(xiàn)出遺傳性的高血糖，F(xiàn)5代的高血糖表現(xiàn)得更加顯著，F(xiàn)5代50%以上個(gè)體的空腹血糖穩(wěn)定在6.0 mmol/L以上。

2.2 體重、空腹血糖、餐后2 h血糖和糖代謝相關(guān)指標(biāo)結(jié)果

在體重、FPG、2 hPG和糖代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)中，高血糖家系組FPG、2 hPG、HbA1c和HOMA-IR的水平比正常組的顯著升高(P< 0.05)；兩組體重、INS和GC的水平差異無顯著性。(表1)

圖1 巴馬小型豬高血糖家系圖譜

表1 體重、空腹血糖、餐后2 h血糖和糖代謝相關(guān)指標(biāo)結(jié)果(n=10)

Table 1 Results of body weight, FPG, 2 h PG, and glucose metabolism-related indexes

分組正常組高血糖家系組GroupsNormal groupHyperglycemia group體重body weight(kg)18.04±2.1818.52±1.04空腹血糖FPG(mmol/L)3.25±0.766.28±1.78**餐后2 h血糖2 hPG(mmol/L)3.40±0.616.66±1.72**胰島素INS(μIU/mL)16.54±2.6615.19±2.77胰高血糖素GC(pg/mL)284.95±30.18273.00±32.52糖化血紅蛋白HbA1c(ng/mL)248.01±40.12288.20±36.30*胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR2.42±0.844.15±1.19**

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。Note. Compared with the normal group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.3 靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)兩組的個(gè)體進(jìn)行靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)，在注射完50%的葡萄糖注射液后，兩組的血糖水平都立即上升到28 mmol/L以上，之后血糖水平逐漸恢復(fù)，在60 min時(shí)基本恢復(fù)到空腹血糖水平。在60 min時(shí)，高血糖家系組的血糖水平下降到比空腹血糖還低的4.71 mmol/L，到120 min時(shí)恢復(fù)到5.97 mmol/L。高血糖家系組的FPG、30 min血糖水平和120 min血糖水平比正常組的顯著升高(P< 0.05)；兩組的0 min、10 min和60 min血糖水平差異無顯著性。(圖2)

2.4 血液生理檢測(cè)結(jié)果

在血液生理各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)中，兩組的各項(xiàng)指標(biāo)差異均無顯著性。(表2)

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。FPG表示空腹血糖水平。

表2 血液生理結(jié)果(n=10)

Table 2 Results of blood physiological indexes

分組正常組高血糖家系組GroupsNormal groupHyperglycemia group白細(xì)胞WBC(109/L)21.76±3.6022.23±7.51紅細(xì)胞RBC(1012/L)7.94±0.448.01±0.62血紅蛋白HGB(g/L)144.00±9.43144.10±13.06紅細(xì)胞比容HCT(%)45.20±2.9644.71±5.51紅細(xì)胞平均體積MCV(fL)57.00±3.0855.75±3.97紅細(xì)胞平均血紅蛋白量MCH(pg)18.16±0.9817.99±0.70紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度MCHC(g/L)318.55±5.37323.40±14.35血小板PLT(109/L)620.00±72.28615.90±134.20紅細(xì)胞分布寬度RDW-SD(fL)38.94±2.2740.60±3.68紅細(xì)胞分布寬度RDW-CV(%)21.95±1.4523.09±1.73中性粒細(xì)胞NEUT#(109/L)4.53±1.245.50±2.83淋巴細(xì)胞LYMPH#(109/L)14.99±2.9314.56±5.48單核細(xì)胞MONO#(109/L)1.41±0.321.29±0.31嗜酸性粒細(xì)胞EO#(109/L)0.61±0.350.65±0.46嗜堿性粒細(xì)胞BASO#(109/L)0.21±0.110.24±0.17中性粒細(xì)胞百分比NEUT%21.08±5.6924.56±10.71淋巴細(xì)胞百分比LYMPH%68.70±4.4365.44±9.23單核細(xì)胞百分比MONO%6.50±0.936.03±1.46嗜酸性粒細(xì)胞百分比EO%2.75±1.572.80±1.65嗜堿性粒細(xì)胞百分比BASO%0.96±0.481.17±0.97

2.5 血液生化檢測(cè)結(jié)果

在血液生化各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)中，高血糖家系組膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平比正常組的顯著升高(P< 0.05)；兩組其余的血液生化指標(biāo)差異均無顯著性。(表3)

3 討論

在相同的環(huán)境、飼喂和年齡等條件下，相比正常普通的巴馬小型豬，高血糖家系的F 5代個(gè)體在空腹血糖、餐后2 h血糖和糖化血紅蛋白的檢測(cè)結(jié)果上顯示出更高的血糖水平。高血糖是糖尿病最顯著的特征，現(xiàn)在臨床上主要用血糖水平來作為糖尿病的診斷指標(biāo)。根據(jù)美國糖尿病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合以下條件之一，則可以確診為糖尿?。?1)空腹血糖FPG ≥ 7.0 mmol/L；(2)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)2 hPG ≥ 11.1 mmol/L；(3)糖化血紅蛋白HbA1c ≥ 6.5%；(4)有典型糖尿病癥狀且任意時(shí)刻血糖PG ≥ 11.1 mmol/L(前三項(xiàng)需要復(fù)檢才能確診)。實(shí)驗(yàn)小型豬的糖代謝、血液指標(biāo)和糖耐量試驗(yàn)反應(yīng)過程與人類的十分相似，因此有學(xué)者指出小型豬糖尿病的判斷標(biāo)準(zhǔn)可以參照人類的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。亦有學(xué)者對(duì)一個(gè)巴馬小型豬群體進(jìn)行測(cè)量和篩選，最后參照人類的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，確立了巴馬小型豬的糖尿病標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖 > 6.9 mmol/L，靜脈給糖后2 h血糖 > 8.2 mmol/L[5]。在連續(xù)多次的檢測(cè)中，高血糖家系目前的F 5代個(gè)體中有4頭的空腹血糖水平保持在7.0 mmol/L左右的水平，而其中1頭的靜脈給糖后2 h血糖達(dá)到了8.9 mmol/L。

糖耐量可以衡量機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力，糖耐量一旦受損，很容易發(fā)展為糖尿病。臨床上通常采用口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)來對(duì)糖耐量進(jìn)行評(píng)價(jià)，但實(shí)驗(yàn)小型豬使用該方法操作較為不便而且容易造成誤差，所以本實(shí)驗(yàn)采取靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)(IVGTT)對(duì)小型豬的糖耐量進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢測(cè)結(jié)果顯示，高血糖家系組的糖耐量并未受損，對(duì)于血糖的變化有正常的調(diào)節(jié)能力。

在機(jī)體內(nèi)，血糖的調(diào)節(jié)主要通過神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)，其中胰島素和胰高血糖素為主要的參與者。在患有糖尿病的情況下，血糖的調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常，1型糖尿病主要因?yàn)橐葝uβ細(xì)胞損傷從而胰島素分泌不足，而2型糖尿病則主要因?yàn)橐葝u素抵抗和胰島β細(xì)胞功能異常[6]?，F(xiàn)在有研究表明，2型糖尿病不僅存在胰島β細(xì)胞的異常，還會(huì)有胰島α細(xì)胞分泌的異常，胰高血糖素的異常分泌會(huì)促進(jìn)高血糖和糖尿病的發(fā)生[7]。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)由Matthews等提出[8]，可以用于胰島素抵抗的評(píng)估，計(jì)算公式為HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。在本實(shí)驗(yàn)中，高血糖家系組的個(gè)體表現(xiàn)出了高血糖水平，但其胰島素和胰高血糖素的分泌并沒有出現(xiàn)異常，說明血糖異常的原因不是胰島素或者胰高血糖素的異常分泌。對(duì)于HOMA-IR的計(jì)算結(jié)果，高血糖家系組的HOMA-IR值明顯高于正常組的，說明高血糖家系組的個(gè)體存在著明顯的胰島素抵抗。當(dāng)機(jī)體存在胰島素抵抗時(shí)，組織和細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)性和敏感性會(huì)降低，導(dǎo)致胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取和利用效率下降，從而使機(jī)體保持高血糖水平。造成胰島素抵抗有多種原因和機(jī)制，例如肥胖、氧化應(yīng)激反應(yīng)、受體底物磷酸化作用、細(xì)胞器功能障礙等[9]，對(duì)于高血糖家系胰島素抵抗的成因尚未清楚，有待進(jìn)一步的探究。

表3 血液生化結(jié)果(n=10)

注：與正常組比較，*P< 0.05。Note. Compared with the normal group,*P< 0.05.

糖尿病的發(fā)生經(jīng)常伴有脂類的代謝異常，主要為CHOL、TG、HDL-CH和LDL-CH的代謝紊亂。多個(gè)臨床上的研究結(jié)果表明，糖尿病患者會(huì)伴隨TG、LDL-CH的增高和HDL-CH的降低[10-11]，因此可以通過血脂的監(jiān)測(cè)對(duì)糖尿病進(jìn)行早期預(yù)防。血脂異常的發(fā)生與胰島素抵抗有關(guān)，胰島素抵抗會(huì)影響機(jī)體內(nèi)TG和HDL-CH的調(diào)控[12]。在本實(shí)驗(yàn)的血液生化檢測(cè)結(jié)果中，高血糖家系組的TG和HDL-CH水平與正常組的差異不明顯，但其CHOL和LDL-CH都高于正常組的水平，與上述臨床研究中糖尿病患者的血脂檢測(cè)結(jié)果相一致，說明高血糖家系組存在一定程度的脂類代謝異常。

糖尿病不僅僅會(huì)伴隨血液生化指標(biāo)的改變，還會(huì)對(duì)多項(xiàng)血液生理指標(biāo)造成影響，如艾爾肯·塔西鐵木爾等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的單核細(xì)胞百分比、血紅蛋白、平均紅細(xì)胞體積、血小板平均分布寬度均明顯低于正常個(gè)體；李芳等[14]則發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的血小板計(jì)數(shù)(PLT)低于健康人群，而血小板分布寬度(PDW)、血小板平均容積(MPV)和血小板比率(P-LCR)均高于健康人群。因此，可以通過血液生理指標(biāo)的檢測(cè)來對(duì)糖尿病的發(fā)生進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但本實(shí)驗(yàn)中兩組血液生理的檢測(cè)結(jié)果差異不明顯。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)高血糖家系F5代個(gè)體的一系列指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，該家系的F5代個(gè)體表現(xiàn)出高血糖和脂類代謝異常，其高血糖表現(xiàn)可能與胰島素抵抗有關(guān)。雖然有部分個(gè)體達(dá)到糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)，但通過其他檢測(cè)指標(biāo)的綜合評(píng)定，筆者認(rèn)為這些個(gè)體尚未發(fā)展為糖尿病。目前，對(duì)該巴馬小型豬高血糖家系的選育策略為：進(jìn)一步擴(kuò)大種群，篩選性狀穩(wěn)定的個(gè)體作為培育對(duì)象。筆者認(rèn)為，通過進(jìn)一步的繁殖和培育，該家系的個(gè)體有望成為研究糖尿病的動(dòng)物模型。