郝志強，王勤章，倪 釗，錢 成，申茂磊，錢 彪

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，石河子 832000)

泌尿系任何部位均可發(fā)生結(jié)石但最常始發(fā)于腎，腎結(jié)石在形成時多位于腎盂或腎盞，腎臟內(nèi)晶體和有機物質(zhì)的大量異常累積，最終導(dǎo)致腎結(jié)石發(fā)病。結(jié)石中90%含有鈣，其中草酸鈣結(jié)石最常見。目前對于腎結(jié)石的研究最常用的是乙二醇實驗動物模型，在本課題前期研究中發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌Nanobacteria,NB)是結(jié)石的原因之一，并且成功利用納米細(xì)菌建立了動物模型[1]，為評價納米細(xì)菌的成石效能，現(xiàn)將兩種模型成石過程中血、尿生化做一個動態(tài)研究，旨在為腎結(jié)石病因?qū)W的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取6周齡左右，體重(200±20) g，Wistar雄性大鼠60只，實驗動物均是來源于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的SPF級雄性大鼠。合格證號[SCXK(新)2013-0001]；新醫(yī)動字[SYXK(新)2010-0003];福利倫理審查證號 [2016]院倫審動實字(001)號(NO)A2016-001。把60只大鼠按隨機數(shù)表法分為納米細(xì)菌組(NB組，30只)和乙二醇組(EG組，30只)，兩組大鼠均先于新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼料購自石河子大學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗試劑與儀器

電子天平(LT1000B，江蘇常熟市大量儀器有限責(zé)任公司)，全自動生化分析儀(Modual DPP，德國羅氏)，多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(BX40，日本Olympus)，透射電鏡(JEOL-1230 Electronics，日本JEOL)。

納米細(xì)菌懸濁液(自制)、0.9%生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司)、1.25%乙二醇(天津永晟精細(xì)化工有限公司)飲水、1%氯化銨(天津永晟精細(xì)化工有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米細(xì)菌的制備

納米細(xì)菌來源于腎結(jié)石患者清潔中段晨尿，收集標(biāo)本后提取并培養(yǎng)，具體操作如下：收集標(biāo)本5 mL，生理鹽水稀釋2倍后濾器過濾、離心取管底液1 mL，加入DMEM及熱滅活胎牛血清培養(yǎng)，5%CO2,37℃, 28～30 d換液1次，培養(yǎng)6～8周，每30 d換液1次。篩選出無污染的標(biāo)本制成NB懸液。

1.3.2 模型的建立及標(biāo)本采集

將60只大鼠隨機分為納米細(xì)菌組(NB組，尾靜脈注射1.2 mL NB懸液，30只)和乙二醇組(EG組，1.25%乙二醇飲水+1%氯化銨2 mL/d灌胃，灌胃持續(xù)時間為2 w，30只)，實驗周期為10 w，每周每組各處死大鼠3只，處死前采集大鼠血、尿標(biāo)本，供生化分析，并取兩側(cè)鮮活腎臟標(biāo)本，供病理結(jié)晶情況檢測及腎體比(腎臟重量/體重×100%)的計算。

1.3.3 記錄大鼠一般情況

連續(xù)觀察10 w內(nèi)各組大鼠飲食飲水、行為活動等情況，并實時測量記錄其體重變化。

1.3.4 病理組織學(xué)檢查

肉眼觀察腎臟的顏色及其大小改變。將標(biāo)本經(jīng)固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固等步驟，制成石蠟病理切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)晶的形成情況,按文獻提供的腎臟結(jié)晶分級判定標(biāo)準(zhǔn)[1]，0級記為陰性，I-IV級記為陽性，進行綜合、統(tǒng)計。

1.3.5 生化指標(biāo)

使用全自動生化分析儀檢測肌酐，尿素，尿酸，尿鈣，血鈣，血鎂，血磷等生化指標(biāo)，進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況

第1～2周，兩組大鼠均表現(xiàn)無異，飲食飲水良好，且性情安靜溫順；自第3周開始，兩組大鼠逐步出現(xiàn)差異，第3～8周，相較于NB組而言，EG組大鼠在性情及活動度等方面表現(xiàn)更為強烈，后者活動度明顯升高且變得煩躁不安；第9～10周，兩組大鼠在飲食飲水、精神狀態(tài)、活動度等方面均有不同程度下降。相比而言，NB組大鼠食欲減低，活動減少，精神倦怠，而EG組在此基礎(chǔ)上，更加表現(xiàn)出針刺反應(yīng)遲鈍等反應(yīng)。且在造模期間，清理EG組大鼠墊料時，可見明顯血尿痕跡，并有2只大鼠意外死亡。

2.2 腎臟標(biāo)本觀察

連續(xù)性觀察10周內(nèi)兩組大鼠腎臟大體標(biāo)本，肉眼可見，第1～2周兩組大鼠均無明顯改變，腎臟表面光滑，腎皮質(zhì)剖面為暗紅色，髓質(zhì)呈灰白色，腎門處可見腎乳頭、腎盞、腎盂等正常結(jié)構(gòu)；自第3周開始，乙二醇組較納米細(xì)菌組大鼠腎臟略有增大，腎皮質(zhì)剖面呈紅褐色，髓質(zhì)呈橘黃色，皮髓結(jié)構(gòu)清晰，腎盞及腎孟良好。第6周以后納米細(xì)菌組部分腎臟皮髓結(jié)構(gòu)尚清晰，但有少量散在淡黃色顆粒沉積在腎組織中，觸之有沙礫感。乙二醇組大鼠腎臟腫大，顏色變淺或發(fā)白，剖面呈淡黃色，皮髓結(jié)構(gòu)不清晰，可見淡黃色顆粒沉積在皮髓交界處，觸之有沙粒樣感覺，在解剖顯微鏡下，晶體以腎盂為中心呈扇形分布。稱重計算其腎體比結(jié)果顯示，差異無顯著性。(表1)

2.3 光學(xué)顯微鏡觀察

顯微鏡下可見：納米細(xì)菌組大鼠自第4周起，其腎臟病理切片可見灰白色晶體，10周計數(shù)，納米細(xì)菌組大鼠腎臟晶體陽性11只(陽性率52.4%)，自第3周起，乙二醇組大鼠腎臟切片可見明亮晶體，主要分布于遠(yuǎn)曲小管，近曲小管及部分腎小球周圍，形態(tài)不規(guī)則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體互相連接成片成團。兩組數(shù)據(jù)運用Fisher確切概率法計算其統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果顯示P≈0.889，差異無顯著性。(因NB組大鼠在第4周開始成石，EG組大鼠在第3周開始成石，而前幾周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計算成石率時將之前已處死的大鼠排除在大鼠總計數(shù)之外)(表2)

2.4 血液生化分析比對

采集大鼠血液標(biāo)本進行檢測，結(jié)果顯示：1～10周內(nèi)，納米細(xì)菌組與乙二醇組在血鈣、血鎂、血磷、肌酐、尿酸、尿素等六個層面，均顯示二者差異不顯著(P> 0.05)。(表3)

2.5 尿液成分分析比較

收集兩組大鼠尿液標(biāo)本進行檢測分析得：對1～10周內(nèi)，納米細(xì)菌組與乙二醇組的尿鈣、尿pH、尿比重、24 h尿量等四個方面進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，兩組差異無顯著性(P>0.05)。(表4)

3 討論

腎結(jié)石是泌尿外科的常見病，容易復(fù)發(fā)，有資料顯示，經(jīng)體外沖擊波碎石技術(shù)治療后的泌尿系結(jié)石患者的結(jié)石復(fù)發(fā)率隨著時間增長而有所升高，其中第1年復(fù)發(fā)率為6.7%，至第5年復(fù)發(fā)率則增長到41.8%[2]。未解決這一問題，本課題組積極探尋一種與腎結(jié)石形成過程相似的方式，改進造模手段，旨在為腎結(jié)石病因?qū)W的研究尋求突破。

腎結(jié)石主要類型為草酸鈣結(jié)石[3]，究其原因，系體內(nèi)草酸代謝紊亂所致[4]。以往的研究，大都通過乙二醇構(gòu)建動物疾病模型[5]。乙二醇為草酸代謝通路的中間產(chǎn)物，亦是草酸的前體[6-7]。因此，攝入乙二醇可導(dǎo)致動物體內(nèi)草酸增加而形成草酸鈣[8]，從而成功構(gòu)建Wistar雄性大鼠腎結(jié)石模型。

表1 納米細(xì)菌組與乙二醇組腎體比比較

注：與乙二醇組比較，腎體比差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant difference.

表2 納米細(xì)菌組與乙二醇組病理結(jié)晶情況(%)

注：與乙二醇組比較，病理結(jié)晶情況差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant difference.

表3 納米細(xì)菌組與乙二醇組血液生化分析(n=60)

注：與乙二醇組比較，差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant differences.

表4 納米細(xì)菌組與乙二醇組尿液生化分析(n=60)

注：與乙二醇組比較，差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant differences.

近年來，納米細(xì)菌在機體鈣化性疾病中的作用逐漸凸現(xiàn)出來，據(jù)資料顯示，NB是體內(nèi)唯一可以產(chǎn)生羥基磷灰石的生物[9]，在泌尿系結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色[10]，NB所特有的生物礦化功能在臨床許多鈣化性疾病中都得到了有效驗證[11]。NB作為鈣化的核心[12-13]，進一步促進了鈣化的發(fā)展。NB在吸引并聚集的同時，還能夠侵入并破壞腎集合管的腎乳頭細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞[14]，形成結(jié)晶核心，這種晶體核心作為常見的結(jié)石前體[15]，最終誘發(fā)結(jié)石形成。

本研究同時構(gòu)建了兩種Wistar大鼠腎結(jié)石模型，最終兩種方法都成功使大鼠形成腎結(jié)石。檢測兩組大鼠的成石率、血、尿生化，顯示二者差異無顯著性，兩種造模方式均可應(yīng)用于腎結(jié)石的研究。但納米細(xì)菌來源于腎結(jié)石本身，這一造模方式與腎結(jié)石形成更加相似，更有利于腎結(jié)石成因的研究。另外兩種造模方式各項指標(biāo)的統(tǒng)計學(xué)檢驗，表明NB造模得以實施。從血、尿生化等各項指標(biāo)來看，NB成石效能有一定意義。

造模期間觀察兩組大鼠一般情況，NB組大鼠食欲減低，活動減少，精神倦怠，而EG組在此基礎(chǔ)上，發(fā)生針刺反應(yīng)遲鈍等反應(yīng)。且在造模期間，清理EG組大鼠墊料時，可見明顯血尿痕跡，并有2只大鼠意外死亡。表明傳統(tǒng)的乙二醇造模方式，對大鼠機能的損害更為嚴(yán)重，納米細(xì)菌造模稍加溫和。

對實驗結(jié)果，包括腎體比、病理結(jié)晶數(shù)、血液生化、尿液生化等諸多指標(biāo)進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，上述指標(biāo)之中，兩組差異均無顯著性，在造模的完成度上，二者沒有差異，均可以達(dá)到理想狀態(tài)，并成功構(gòu)建Wistar雄性大鼠腎結(jié)石模型。提示改良的造模方式是有意義的。

綜上所述，納米細(xì)菌作為腎結(jié)石的成因之一，可通過其自身的礦化反應(yīng)，影響草酸鈣代謝，形成結(jié)石。

致謝：

本文研究得到了錢彪副教授的大力支持，同時感謝石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室的眾多幫助，在此謹(jǐn)致真誠謝意。