史長華，張 玲，陳 巍，付信靖，秦 川

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種老年人中常見的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的神經(jīng)退行性疾病。AD的病理改變與大腦內(nèi)老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成有關(guān)。可能的機(jī)制包括β淀粉樣肽(amyloid beta，Aβ)沉積、炎癥損傷、氧化應(yīng)激等。主要累及部位為皮層和海馬。在對118例AD患者神經(jīng)影像學(xué)的觀察中發(fā)現(xiàn)，AD患者常出現(xiàn)的妄想，淡漠，抑郁等精神癥狀與前額葉皮層緊密相關(guān)[1]。然而目前在AD的研究中，差異基因表達(dá)及其功能研究主要集中于全腦或海馬區(qū)，尚無前額葉皮層差異分析的系統(tǒng)闡述。RNA深度測序(RNA-Seq)是近年來快速發(fā)展的高通量測序技術(shù)，具有信噪比高、分辨率高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢。本研究擬利用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因動物模型，采用RNA-Seq技術(shù)研究AD模型小鼠和野生型小鼠前額葉皮層的基因表達(dá)變化，篩選出AD相關(guān)特異性的基因，為利用模型小鼠進(jìn)行AD相關(guān)機(jī)制和治療研究提供一些思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雌性APP swe /PS1ΔE9 (PAP)雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠和野生型C57BL/6 J小鼠各5只，9月齡，體重約26～30 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [SCXK-(京)2014-0004]，實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所開展 [SYXK-(京)2015-0035]。動物實(shí)驗(yàn)方案獲實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會(IACUC)的批準(zhǔn) [ILAS-QC-2016-001]。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol購自美國 Invitrogen 公司；DEPC水購自美國QIAGEN公司；PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒購自日本Takara公司；Ethovision XT動物軌跡跟蹤與行為觀察記錄分析系統(tǒng)購自荷蘭Noldus公司；UltraSYBR mixture(with ROX)購自日本Takara公司。HiSeq 3000測序儀購自美國Illumina公司；引物購自中國Invitrogen公司；Qubit 2.0定量儀購自美國Invitrogen公司；Agilent 2100購自美國Agilent公司；PCR儀購自美國Bio-Rad 公司；ABI stepone熒光定量 PCR儀購自美國Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 轉(zhuǎn)基因動物的鑒定

PCR 鑒定小鼠的基因型，針對人APP、PS1 基因合成的hAPP正向引物為： 5’-GACTG ACCACTC GACCAGGTTCTG-3’，反向引物：5’-CTTGTAAG TTGGATTCTCATATCCG-3’，產(chǎn)物長度 344 bp；hPS1 正向引物為：5’-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3’，反向引物：5’-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3’，產(chǎn)物長度608 bp。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[2]用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測AD模型和野生型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮隱藏平臺實(shí)驗(yàn)中潛伏期數(shù)據(jù)使用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其余結(jié)果采用t檢驗(yàn)，以P< 0.05 為差異有顯著性。

1.3.3 腦組織總 RNA提取

Trizol法提取前額葉皮層總RNA，分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Agilent 2200檢測RNA樣品的純度、濃度和完整系數(shù)(RNA integrity number，RIN)等，以保證使用合格的樣品進(jìn)行測序。

1.3.4 文庫構(gòu)建、質(zhì)檢與測序

提取樣本RNA后，將rRNA去除，并將RNA片段化(平均長度為200 nt左右)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行粘性末端修復(fù)，cDNA的3’末端加上poly(A)尾并連接測序接頭，利用瓊脂糖凝膠電泳選出大于200 nt的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到測序用的cDNA文庫。構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100分析儀和ABI StepOne Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)質(zhì)檢，質(zhì)檢選出片段大小為260 bp左右的文庫加入流動槽的各通道中，以Paired-End方式進(jìn)行測序。

1.3.5 基因組比對及差異表達(dá)基因分析

經(jīng)軟件Tophat2將測序數(shù)據(jù)比對到小鼠參考基因組GRCm38，此時(shí)可得到一個(gè)bam文件，記錄了每條reads對應(yīng)的染色體位置。使用DESeq軟件對基因進(jìn)行定量分析。采用edgeR軟件(3.12.1)進(jìn)行表達(dá)差異顯著性分析(P< 0.05, |logFC| > 1.0)，并對AD樣本的表達(dá)值(RPKM)進(jìn)行聚類分析。

1.3.6 GO和KEGG分析

利用 DAVID 軟件對差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能(生物學(xué)過程，BP)及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析通路富集分析，幫助了解差異表基因的功能。統(tǒng)計(jì)方法為 Fisher’s exact test，Benjamini 算法校正，以校正后P< 0.05 為差異有顯著性。

1.3.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

選取6個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其中包括3個(gè)上調(diào)基因：Trem2、Lyz2、Ctse，3個(gè)下調(diào)基因：S100a8、S100a9、Ttr。AD模型小鼠和野生型小鼠前額葉皮層總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用UltraSYBR mixture試劑盒進(jìn)行檢測。以β-actin為參考基因，每個(gè)mRNA 的相對表達(dá)值通過2-△△Ct計(jì)算。差異基因引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 APP swe /PS1 ΔE9(PAP)雙轉(zhuǎn)基因 AD模型小鼠基因型鑒定

目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后可分別在344 bp和608 bp附近位置出現(xiàn)明顯的兩條條帶，即可確定為攜帶APP/PS1基因的陽性小鼠。如圖1所示，兩條帶即為目的基因片段。

表1 qRT-PCR 引物序列

注：M：Marker，N：陰性對照，P：陽性對照，1～5為陽性小鼠。

2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如圖2 A所示，在小鼠水迷宮空間探索階段，AD組相對于野生型小鼠自第三天起尋找平臺所用的潛伏期即開始增加(P< 0.05，第3 ～ 6天)；如圖2B，2C所示，AD模型小鼠在水迷宮空間探索的穿越平臺象限和穿越平臺次數(shù)有明顯下降(P< 0.05)。

2.3 總RNA質(zhì)量檢測

AD模型小鼠組與對照組前額葉皮層組織信息見表2。腦組織RNA濃度符合測序要求(≥350 ng/μL)(表2)。結(jié)果顯示，所有RNA樣品的RIN值均在7.1～8.6之間，證明這些RNA樣品純度和完整性可用于后續(xù)的文庫構(gòu)建及測序。

2.4 差異表達(dá)基因

在AD模型小鼠與野生型小鼠之間發(fā)現(xiàn)224個(gè)差異基因(P< 0.05, |logFC| > 1.0)，其中205個(gè)基因上調(diào)，19個(gè)基因下調(diào)。前20個(gè)差異表達(dá)基因見表3。繪制火山圖(圖3 A)以展示差異顯著性基因的整體分布情況。使用層次聚類對樣本的表達(dá)值RPKM進(jìn)行聚類分析(圖3B)。

2.5 GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析

為了揭示差異表達(dá)基因在AD模型小鼠中參與的生物學(xué)過程，對差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG 通路富集分析。差異表達(dá)基因GO富集的生物過程(圖4A)主要有免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，富集的分子功能(圖4B)主要包括細(xì)胞膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，富集的細(xì)胞成分(圖4C)主要包括趨化因子活動以及IgG結(jié)合等。KEGG 富集分析結(jié)果(圖4D)顯示差異基因參與了吞噬、溶酶體、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號通路、朊蛋白病、NF-κB信號通路等。

注：A：隱藏平臺實(shí)驗(yàn)中小鼠尋找平臺所用的潛伏期；B和C分別是空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺象限及平臺的次數(shù)； *P< 0.05。

樣本號CaseID濃度(ng/μL)Concentration OD260/OD280OD260/OD230RIN28S/18SCon-1494.291.862.427.51.7Con-2706.471.92.157.61.4Con-3331.071.912.037.82.1Con-4586.621.82.168.61.8Con-5455.041.892.397.31.9AD-1697.791.911.837.22.2AD-2457.341.892.337.41.2AD-3619.531.881.678.22AD-4452.661.862.397.11.7AD-5802.961.92.178.61.4

注：Con-1～Con-5是野生型小鼠的前額葉皮層組織，AD-1～AD-5是AD模型小鼠前額葉皮層組織，每組各5例，RNA指控標(biāo)準(zhǔn)是：RIN ≥ 6.5，28S/18S > 0.8和260/280 > 1.8。Note: Con-1-Con-5 present five prefrontal cortex tissues of wide mice, AD-1-AD-5 present five prefrontal cortex tissues of AD mice, The standard for RNA allegations is: RIN ≥ 6.5, 28S/18S > 0.8 and 260/280 > 1.8.

注：A：橫坐標(biāo)表示基因在不同樣本中的表達(dá)倍數(shù)變化 (log 2 fold change)，縱坐標(biāo)表示表達(dá)差異的顯著性水平 (-log 10 P-value)，紅色表示差異基因；B：熱圖中紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)。

注：A：生物過程；B：分子功能；C：細(xì)胞組成；D：KEGG富集分析。

表3 AD模型小鼠與對照組比較的差異基因

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證

根據(jù)嗜神經(jīng)相關(guān)差異基因篩選結(jié)果和文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，選取6 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，其中包括3個(gè)上調(diào)基因：Trem2、Lyz2、Ctse，3個(gè)下調(diào)基因：S100a8、S100a9、Ttr。qRT-PCR結(jié)果顯示6個(gè)關(guān)鍵基因上、下調(diào)趨勢與RNA-Seq結(jié)果(圖5)相一致。

3 討論

圖5 差異基因的RNA-Seq結(jié)果以及qRT-PCR 的驗(yàn)證結(jié)果

在目前AD的研究過程中，APP /PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是最常用的動物模型，本實(shí)驗(yàn)所采用的APP /PS1雙轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠由本所遺傳中心構(gòu)建培育。該模型以C57BL/6 J小鼠為背景，含有人APP swedish 突變位點(diǎn)(K595 N/M596 L)和人PS1ΔE9突變位點(diǎn)，其在3月齡出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶缺陷，4.5月齡開始出現(xiàn)老年斑[3]，9～12月齡出現(xiàn)大量老年斑[4-5]，具有和AD患者相似的病理表型，本研究中AD模型小鼠較對照組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。該過程涉及多種基因及其產(chǎn)物之間的相互作用、多種信號通路相互調(diào)節(jié)和拮抗[6-7]，故在整體水平上研究AD模型小鼠基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律十分必要。隨著高通量技術(shù)的快速發(fā)展，RNA-Seq 技術(shù)日趨成熟。該技術(shù)對特定組織或細(xì)胞在某個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA進(jìn)行測序，可研究已知基因并能發(fā)現(xiàn)新基因，并可在不同的疾病狀態(tài)、不同的環(huán)境條件下對以前未檢測到的變化提供可見性。本研究針對AD模型小鼠和野生型小鼠前額葉皮層組織中基因表達(dá)水平變化，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析；在這些差異的基因中選取3個(gè)上調(diào)的基因(Trem 2[8]，Lyz 2[9]和Ctse[10])和3個(gè)下調(diào)的差異基因(Tlr[11]，s100a8和s 100a9[12])，這6個(gè)基因在AD相關(guān)研究中均有異常表達(dá)，采用 qRT-PCR做驗(yàn)證，結(jié)果顯示，這些差異基因與測序結(jié)果表達(dá)一致，說明該技術(shù)重復(fù)性較好、可信度高。

本研究共發(fā)現(xiàn)224條差異表達(dá)基因，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析結(jié)果表明：差異表達(dá)基因主要參與了免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、toll樣受體信號通路和細(xì)胞因子受體相互作用等重要生物學(xué)通路。免疫反應(yīng)相關(guān)的差異基因有Toll樣受體2(toll-like receptor 2, TLR2)、Tlr、App、髓細(xì)胞激活受體2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2, TREM2)等。Trem2基因在人類位于6p21.1，在小鼠存在于17號染色體，在多種髓系來源的細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞，破骨細(xì)胞，組織巨噬細(xì)胞廣泛表達(dá)[8]。有證據(jù)表明，過表達(dá)AD小鼠TREM2水平可改善小鼠認(rèn)知功能[13]，敲除TREM2基因出現(xiàn)明顯的Aβ沉積和小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙[14]，從而加重小鼠的認(rèn)知損害?？傊琓REM2對小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮抗炎、吞噬和清除凋亡神經(jīng)元以及Aβ具有重要作用。本研究中，AD小鼠模型前額葉皮層組織TREM2基因表達(dá)上調(diào)，可能提示其表達(dá)水平的增加是一種抵御過度沉積Aβ的良性代償反應(yīng)。本研究中AD腦中Tlr表達(dá)顯著增多，Tlr活化后可激活NF-kB，促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。伴隨炎性因子及氧自由基的產(chǎn)生[11]，致使炎性因子及氧自由基堆積，可損傷蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)過氧化物等生物大分子，引起神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，加重AD的損傷作用。當(dāng)然，上述基因的差異表達(dá)是否參與AD相關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)，toll樣信號通路還需要作進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究通過RNA-Seq得到了AD模型小鼠前額葉皮層組織中高度相關(guān)差異基因，為闡明AD的發(fā)病機(jī)制提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。