戚敏，楊秀娟，陶琳麗，陳琛，曹勝雄，劉廷丹，張曦

（云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南昆明650201）

菲牛蛭（Poecilobdella manillensis），別名馬尼擬醫(yī)蛭，俗名金邊（銅邊）螞蟥，屬醫(yī)蛭科，牛蛭屬，廣泛分布于我國廣西、廣東、海南等地區(qū)[1-2]。菲牛蛭是水蛭的一種，而水蛭是一味傳統(tǒng)動物藥，初載于《神農本草經》，有破血、通經、散瘀的功能；主治血瘀經閉腹痛、癥瘕積聚，跌打損傷[3]。菲牛蛭不僅具有抗凝血的效果、還具有抗血栓、抗腫瘤、抗炎、降血脂、以及治療心腦血管疾病的功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，動物藥中的氨基酸、多肽、蛋白質不僅是營養(yǎng)成分，大多數被科學證實是動物藥中的特效成分[5]。脂肪酸，礦物元素也具有特定的營養(yǎng)價值與生理功能。近年來，由于人們對心血管藥物的迫切需求，人們開始重視對菲牛蛭等吸血蛭類的研究，但研究主要集中于菲牛蛭有效物質的分離鑒定以及作用機理，對于其蛭體成分分析較少。因此，本試驗對菲牛蛭蛭體常規(guī)營養(yǎng)成分、氨基酸組成、脂肪酸組成及礦物元素組成進行測定與分析，為菲牛蛭資源及營養(yǎng)保健食品、藥品的開發(fā)利用提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由云南海瑞迪生物制藥有限公司提供的成體引種菲牛蛭作為試驗素材，將活體菲牛蛭進行稱重后置于-20℃條件下迅速致死，再放入冷凍干燥機內去除水分，進行水分測定，樣品經粉碎機打成粉末后備用。檢測前，將樣品再次放入冷凍干燥機內制備為絕干樣。

1.2 主要儀器及試劑

LC-20AT高效液相色譜儀、GC-2014高效氣相色譜儀、AA-6880F原子吸收分光光度計：日本島津（中國）有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；索氏抽提器：云南省科儀化玻有限公司；JK9830自動凱氏定氮儀：濟南精密科學儀器儀表有限公司；SX2-4-10箱式電阻爐：上海崇明實驗儀器廠；AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。甲醇（優(yōu)級純）、乙腈（色譜純）：tedia company.USA；18種脂肪酸甲酯標準品（色譜純）：美國NU-CHEKPREP公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)組成測定

水分含量測定采用冷凍干燥法。

水分含量X/%=[（Mb-Ma）-（Mc+Md）/2]/（Mb-Ma）×100

式中：Ma為自封袋的袋重，g；Mb為新鮮樣品+自封袋的總重，g；Mc、Md為凍干后無水分的樣品和袋的總重，g。

粗蛋白含量測定使用凱氏定氮法，參照GB/T 9695.11-2008《肉及肉制品氮含量測定》。粗脂肪含量測定，使用索氏抽提法測定，參照GB/T 9695.7-2008《肉及肉制品總脂肪含量測定》。粗灰分含量測定，使用干灰化法測定，參照GB/T9695.18-2008《肉及肉制品總灰分測定》。

1.3.2 氨基酸含量測定

氨基酸測定，使用高效液相色譜法進行檢測。

樣品前處理：取0.3 g絕干樣品，采用酸水解法對樣品進行水解，水解后使用0.02 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL，取200 μL樣品溶液、標準溶液置于1.5 mL離心管內，分別加入三乙胺乙腈溶液100 μL、異硫氰酸苯脂乙腈溶液100 μL至每個離心管中，混勻，室溫靜置1小時后加入正己烷400 μL至各離心管，震蕩后靜置 10 min。取下層溶液（PTC-AA）200 μL，加 800 μL超純水稀釋，搖勻，用0.22 μm針筒式濾膜至自動進樣品瓶中。

分析條件為色譜柱：博納艾杰爾Venusil氨基酸分析專用柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）流動相流速為1.00 mL/min；洗脫梯度見表 1；柱溫：40.0 ℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：254 nm。

表1 流動相梯度Table 1 The mobile phase gradien

1.3.3 脂肪酸含量測定

脂肪酸測定，采用高效氣相色譜法進行測定。

樣品前處理：采用硫酸-甲醇酯化法進行樣品前處理，稱取1 g～2 g左右的樣品置于25 mL雞心瓶中，加入10 mL濃度為10%硫酸甲酯液，在水浴鍋上70℃回流1 h，室溫冷卻后，加2 mL正己烷萃取，充分震蕩，取上清液經0.22 μm針筒式濾膜過濾后備測。

分析條件為色譜柱：RtR-2560（100 mm×0.25 mm×0.2 μm）。載氣：高純氮氣。氣體流量：氮氣40 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。柱溫：240℃進樣口（Split，SPL）溫度：240℃。分流比：10.0。氫離子火焰檢測器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度：250℃。色譜柱升溫程序：起始溫度110℃，保留3 min；然后以4℃/min升溫至240℃，保持50min。進樣量：1 μL。

1.3.4 礦物元素含量測定

礦物元素測定，使用元素采用原子吸收分光光度法測定。

樣品前處理：樣品灰化完全后加入體積比為1∶1鹽酸溶液2.5 mL溶解，并轉移到50 mL容量瓶中，鈣含量的測定使用氯化鑭溶液定容，其他用去離子水定容，隨機將定容好的試樣液先用快速定性濾紙過濾，然后將濾液再用0.22 μm水系濾膜過濾，得到濾液用于鈣、鐵、鋅、銅元素的測定；從上述濾液中準確吸取80 μL于10 mL容量瓶中，用去離子水定容后用于鎂元素測定。

原子吸收光光度計工作條件詳見表2。

表2 原子吸收分光光度計工作條件Table 2 Atomic absorption spectrophotometer’s working conditions

1.4 氨基酸營養(yǎng)評價方法

采用氨基酸比值系數法進行氨基酸營養(yǎng)評價[6-8]：根據1973年聯(lián)合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提出的人體必需氨基酸模式與雞蛋全蛋氨基酸模式[9]，通過公式（1）、（2）、（3）分別計算氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系數（ration coefficient of amino acid，RCAA）、氨基酸比值系數分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA），其中CV為RCAA的變異系數。根據計算結果對菲牛蛭氨基酸營養(yǎng)價值進行對比和分析。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)營養(yǎng)測定結果與分析

菲牛蛭4種常規(guī)營養(yǎng)測定結果見表3。

表3 菲牛蛭4種常規(guī)營養(yǎng)成分（鮮樣）Table 3 Four kinds of routine nutritional components of Poecilobdella manillensis（fresh sample） %

由表3可知，鮮體菲牛蛭粗蛋白含量為16.70%、粗脂肪為1.35%、灰分為1.33%、水分含量為80.55%。常見禽蛋粗蛋白含量約為12%，魚蝦約為17%、瘦肉約為20%；常見肉類脂肪含量約為2.3%～11.8%[10]。菲牛蛭粗蛋白高于禽蛋、低于瘦肉、與魚蝦粗蛋白含量相近，脂肪含量低于常見肉類。豬、牛、羊3種哺乳動物血液中的粗蛋白含量約為17%～18%、粗脂肪含量約為0.3%～0.4%、灰分含量0.8%～1.1%、水分含量約為80%[11]。菲牛蛭蛭體粗蛋白與水分含量與這3種動物血液十分接近，而粗脂肪與灰分含量略高于3種動物血液，從常規(guī)營養(yǎng)的角度來看，菲牛蛭粗蛋白含量與魚類相當，營養(yǎng)成分與家畜血液相近。

2.2 氨基酸測定結果與分析

菲牛蛭17種氨基酸測定結果見表4。

表4 菲牛蛭與其他4種水蛭的17種氨基酸含量（絕干樣）Table 4 The amount of 17 amino acids in the Poecilobdella manillensis and the other 4 hirudos（dry sample） %

由表4可知，試驗所測定的菲牛蛭17種氨基酸總量（TAA）為66.09%，其中必需氨基酸（EAA）含量為24.37%，非必需氨基酸含量（NEAA）為41.72%。與日本醫(yī)蛭、螞蟥、柳葉螞蟥[12]和寬體金線蛭[13]4種水蛭相比，菲牛蛭TAA、EAA、NEAA含量最高。蛋白質的營養(yǎng)價值不僅取決于氨基酸含量高低，還取決于必需氨基酸的組成比例[14]。本研究中，菲牛蛭EAA/TAA的值為36.87%，接近于FAO/WHO標準中40%的推薦值，EAA/NEAA為58.41%，接近FAO/WHO標準中60%的推薦值，具有良好的氨基酸組成比，說明菲牛蛭氨基酸組成比例平衡，營養(yǎng)價值高。

自然界中的氨基酸有20多種，其中天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、精氨酸9種氨基酸在一般植物中含量少，且有些人體內不能合成，是維持機體氮平衡所必須的，稱為藥用氨基酸（MAA）[15]。谷氨酸是哺乳動物腦內重要的神經遞質，天冬氨酸在預防心臟病、高血壓等疾病起到重要作用；在醫(yī)學上谷氨酸、天冬氨酸用于降低血氨，消除自由氨的毒性作用，保護肝臟以及心臟，恢復其功能[16-17]。而賴氨酸是一種人體必需氨基酸，能夠促進人體大腦神經再生性細胞的合成、增進食欲[18]、治療出血性腦血管病[19]，是以谷物為主食人群的最為缺乏的氨基酸[20]。亮氨酸可以平衡機體能量代謝功能，對于肥胖癥、高血脂癥具有防治作用[21]。菲牛蛭蛭體的谷氨酸含量最高，為9.97%，其次為天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸，MAA含量為43.44%占TAA總量的65.73%，菲牛蛭MAA含量高，菲牛蛭所具有的預防與治療心血管疾病及降血脂的功效或許與MAA高含量的特點有關。此外，菲牛蛭含量最高的5種氨基酸均為MAA，結果與日本醫(yī)蛭、螞蟥、柳葉螞蟥[12]的測定結果一致，但與寬體金線蛭[13]不同。且李軍[22]、丁月珠[23]測定數種水蛭抗凝血效果時發(fā)現(xiàn)：菲牛蛭抗凝血效果最佳；菲牛蛭、日本醫(yī)蛭等吸血蛭類抗凝血效果遠高于非吸血蛭類的寬金線蛭。菲牛蛭等吸血蛭類的抗凝血效果或許與其氨基酸組成具有一定關系。

兩種參考模式下菲牛蛭的氨基酸營養(yǎng)評定結果見表5。

表5 兩種參考模式下菲牛蛭的RAA、RCAA和SRCAA（凍干粉）Table 5 RAA，RCAA and SRCAA of Poecilobdella manillensis in the FAO/WHO pattern and the whole egg reference pattern（freezedried powder）

根據氨基酸比值系數法計算出的RCAA值越接近1，說明該蛋白的氨基酸越接近所對比模式氨基酸，當RCAA＞1時，說明該必須氨基酸相對過剩，當RCAA＜1時，說明該必須氨基酸相對不足；若某種蛋白質氨基酸種類齊全，比例合理，越接近FAO/WHO氨基酸模式要求，則說明該蛋白質營養(yǎng)價值越高，能提供人體營養(yǎng)需求[7]。通過表5可知，在FAO/WHO模式下，除賴氨酸與蛋氨酸+半胱氨酸外，菲牛蛭蛭體蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸的RCAA值都十分接近1，說明其氨基酸組成較為均衡。在全蛋模式下，菲牛蛭的蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸的RCAA值相對低于全蛋模式，賴氨酸高于全蛋模式，其余氨基酸接近于全蛋模式。菲牛蛭的氨基酸模式更加接近于FAO/WHO模式，且FAO/WHO模式的SRCAA評分高于全蛋模式。無論在FAO/WHO模式還是在全蛋模式下，菲牛蛭的第一限制性氨基酸均為蛋氨酸+半胱氨酸。

2.3 脂肪酸測定結果與分析

菲牛蛭18種脂肪酸測定結果見表6。

表6 菲牛蛭18種脂肪酸含量（絕干樣）Table 6 The contents of 18 fatty acids in Poecilobdella manillensis（dry sample） mg/g

由表6可知，試驗所測定的18種脂肪酸總量為27.86 mg/g，飽和脂肪酸（SFA）含量為 12.92 mg/g，不飽和脂肪酸（USFA）含量為15.13 mg/g，必需脂肪酸含量為5.49 mg/g。SFA中的月桂酸和肉豆蔻酸含量與血液中膽固醇的含量呈顯著正相關，被認為是導致冠心?。╟oronary heart disease，CHD）的主要因素，而棕櫚酸能降低血清中的膽固醇含量[24]，硬脂酸能有效降低血栓和動脈硬化發(fā)病概率[25]，調節(jié)膽酸生成[26]，有利于身體健康。菲牛蛭的月桂酸、肉豆蔻酸含量極低，棕櫚酸、硬脂酸含量高，占18種脂肪酸總量的40%左右，從SFA的角度來評價，菲牛蛭的SFA是有益的。USFA由MUFA與PUFA共同構成，MUFA具有降血糖、調節(jié)血脂、保護心臟等功效，其中最具代表性的油酸能夠保護脂蛋白免受氧化，防止動脈損傷[27]；PUFA具有抗心血管疾病、降低血脂、抗癌以及促進生長的作用，畜禽肉中的PUFA含量較少，尤其缺乏亞油酸、亞麻酸[28-30]。菲牛蛭USFA占18種脂肪酸總量的50%以上，雖然幾乎不含亞麻酸，但油酸、亞油酸含量達5.93 mg/g、2.68 mg/g，有益脂肪酸含量較豐富，對人體心腦血管健康具有積極作用。

2.4 礦物元素測定結果與分析

菲牛蛭5種礦物元素測定結果見表7。

表7 菲牛蛭5種礦物元素含量（絕干樣）Table 7 The contents of 5 mineral elements in Poecilobdella manillensis（dry sample） mg/g

由表7所示，菲牛蛭5種礦物元素總量為16.804 mg/g，其中人體常量元素鈣、鎂元素含量分別為12.044、2.357 mg/g，人體微量元素鐵、鋅、銅含量分別為 1.015、1.362、0.026 mg/g，鈣元素含量最高，5 種礦物元素含量呈現(xiàn)鈣＞鎂＞鋅＞鐵＞銅的規(guī)律。菲牛蛭礦物元素的含量與規(guī)律同方富永[31]、苗艷麗[32]研究的結果一致。鈣、鎂元素不僅構成機體骨骼，同時也是多種酶的激活因子；鐵是動物血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素和多種酶的重要組成成分，在呼吸與生物氧化過程中起重要作用；鋅是機體多種酶的構成與激活劑，對動物大腦功能、機體免疫功能、動物機體繁殖性能有重要的影響；銅在機體內生化功能為催化作用，參與人體氧化還原作用，具有維持正常造血功能、保護中樞神經系統(tǒng)健康的功能[33-34]。菲牛蛭礦物元素含量高，對人體健康具有積極作用。

中藥的微量元素含量與其藥效關系密切[34]。試驗所測定的菲牛蛭鐵、鋅、銅元素含量均高于決明子、三七、紅花[36]等8味治療心血管疾病中草藥含量，高于龍葵、白英、昆布[37]等7味抗癌中草藥含量，同時高于同為水蛭類的日本醫(yī)蛭、螞蟥、柳葉螞蟥及金邊螞蟥（寬體金線蛭）[38]的含量。研究證明，菲牛蛭的抗凝血效果優(yōu)于日本、歐洲醫(yī)蛭、優(yōu)于寬體金線蛭[22-23]。一些蛋白質不僅由氨基酸構成，還由非氨基的礦物元素、糖類、酯類等組分一同構成，菲牛蛭抗凝血效果優(yōu)于其他水蛭，其活性蛋白含量與構成可能與其高礦物質的特點有關，這有待進一步的研究。

3 結論

菲牛蛭粗蛋白含量為16.7%、灰分為1.33%、粗脂肪為1.35%、水分含量為80.55%。菲牛蛭氨基酸TAA的值為66.09%，EAA為24.37%，NEAA為41.72%，氨基酸組成比例平衡；其中EAA/TAA的值為36.87%，EAA/NEAA為58.41%，符合FAO/WHO推薦值，具有良好的氨基酸組成比；MAA含量為43.44%，MAA/TAA為65.73%，藥用氨基酸含量高；菲牛蛭的氨基酸模式接近于FAO/WHO模式，氨基酸評分好。菲牛蛭棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸含量豐富，USFA占18種脂肪酸總量的50%以上，有益于心腦血管健康。菲牛蛭富含人體所需的鈣、鎂、鐵、鋅、銅5種礦物元素，礦物元素含量較一般中草藥高。菲牛蛭營養(yǎng)豐富，營養(yǎng)組成極具特點，可以根據菲牛蛭營養(yǎng)特點進行保健食品以及藥品的開發(fā)。