李杰，肖澤濤，郭書賢

（南陽理工學院生化學院，河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南南陽473004）

微生物油脂（microbial lipids）又稱單細胞油脂（single cell lipid，SCO），是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂為碳源、氮源，輔以無機鹽生產(chǎn)的油脂和一些有商業(yè)價值的脂質(zhì)。微生物油脂在能源環(huán)保、食品生產(chǎn)、日用化工等方面有廣泛的應用。在當前人口不斷增長的情況下，對于油脂的需求量巨大，而自然資源卻日益貧乏，因此，開發(fā)新的油脂資源具有重要的現(xiàn)實意義[1-7]。

生物柴油由于燃燒性好并且產(chǎn)生的污染少而受到許多國家的青睞，近年來，生物柴油行業(yè)急劇擴張。粗甘油是生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物，生物柴油行業(yè)規(guī)模的擴張使得副產(chǎn)物粗甘油大量產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計，粗甘油副產(chǎn)物約占總產(chǎn)物量的10%，如何將粗甘油回收利用，成為了一個新的嚴峻挑戰(zhàn)[8-13]。

粗甘油可作為碳源被產(chǎn)油微生物通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化為微生物油脂，相關(guān)的研究已經(jīng)取得了一定進展。2013年，Shen等研究了T.fermentans利用純甘油進行發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況，發(fā)現(xiàn)其最大的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為4.0 g/L、1.4 g/L和35.0%[14]。2015年，Spier等對L.starkeyi利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況進行了研究，試驗表明，發(fā)酵120 h后，L.starkeyi的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為5.74、2.89 g/L和50.49%[15]。2016年，胡洋等利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)微生物油脂的研究中，選取蛋白胨+酵母浸膏作為混合氮源，以粗甘油為碳源，通過改變氮源的含量控制培養(yǎng)基的C/N，結(jié)果表明，C/N 為 60時，T.fermentans、T.cutaneum和L.starkeyi的生物量達到最大值，分別為14.24、15.07 g/L和17.74 g/L；在C/N為110時，油脂含量達到最大值，分別為32.37%、28.55%和32.27%[16]。由此說明，菌株的生長和油脂積累對于C/N的需求是不同的。因此，本研究主要針對產(chǎn)油脂微生物，考察以粗甘油作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，不同碳氮比對其產(chǎn)油脂的影響，以期為微生物利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料

1.1 原料

大豆油：南陽萬德隆超市。

1.2 菌株

斯達油脂酵母1809：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；斯達油脂酵母 ZW-25、MM-17、YP-07：河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室保藏。

1.3 培養(yǎng)基

酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 10，蛋白胨10，pH自然。

YEPD固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，瓊脂粉20，pH自然。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）[17]：葡萄糖 70，（NH4）2SO42.0，酵母粉 0.5，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH 5.8～6.0。

粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基：根據(jù)待考察的粗甘油添加量，用粗甘油替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其余成分同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4 試劑

NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4、MgCl2、CaCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4、Na2SO4、MnSO4·4H2O、KOH、NaCl、H3PO4、葡萄糖、香草醛、甲醇：均為國產(chǎn)分析純。

酵母膏、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉：均為生物試劑。

1.5 主要儀器設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；BSP-150電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；HZQ-B數(shù)顯恒溫搖床：蘇州威爾實驗用品有限公司；SW-CJ超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器有限公司；CX31生物顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；7890A氣相色譜儀：上海天美分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 粗甘油制備

粗甘油的制備參考孔秀梅[18]，按醇油摩爾比4∶1進行酯交換反應，按油重0.32%加入催化劑氫氧化鉀，控制溫度80℃，攪拌反應4 h。反應完成后回收殘余甲醇，然后冷卻靜置。分層后收集下層液體，用50%的H2SO4調(diào)節(jié)pH值至3.0，除去皂化物，即得試驗用粗甘油。

2.2 培養(yǎng)方法

將保存于試管斜面的菌株活化，挑取一環(huán)接種于YEPD液體培養(yǎng)基，25℃，145 r/min培養(yǎng)48 h，作種子液。將種子液以10%接種量分別接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃、145 r/min培養(yǎng)5 d。

2.3 高產(chǎn)油脂菌株的篩選

設(shè)置甘油培養(yǎng)基（試驗組）和葡萄糖培養(yǎng)基（對照組），采用平板培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵的方法對斯達油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07進行培養(yǎng)，篩選出利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的高產(chǎn)菌株進行后續(xù)試驗。

2.4 碳源、氮源對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

2.4.1 粗甘油濃度的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的粗甘油，考察其對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，粗甘油濃度范圍25 g/L～115 g/L，濃度梯度為15 g/L。

2.4.2 氮源種類和濃度的影響

固定發(fā)酵培養(yǎng)基中粗甘油濃度70 g/L，分別考察不同種類氮源對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響；考察有機氮源時固定無機氮源濃度，考察無機氮源時固定有機氮源濃度；有機氮源選擇酵母粉、蛋白胨、尿素，無機氮源選擇 NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4NO3。

2.4.3 碳氮比的影響

固定發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源種類和濃度，改變粗甘油的添加量，選擇粗甘油濃度范圍25 g/L～115 g/L，濃度梯度15 g/L，分別考察不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響。

2.5 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程研究

將斯達油脂酵母ZW-25種子液以10%接種量接種于粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃、145 r/min培養(yǎng)144 h，每隔12小時取樣，測定菌體生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、油脂系數(shù)、pH值和殘余甘油濃度，考察菌株在發(fā)酵過程中各指標的變化規(guī)律。

2.6 試驗指標的測定和計算方法

2.6.1 生物量測定

發(fā)酵液進行離心，將濕菌體105℃烘干至恒重，稱重。菌體生物量以g/L表示（g為干菌體質(zhì)量，L為所用發(fā)酵液體積）[19]。

2.6.2 油脂產(chǎn)量測定（磷酸香草醛顯色法）

分別配制濃度為 0、0.08、0.1、0.12、0.2、0.16 g/L 油脂樣品（溶劑為無水乙醇-正己烷，體積比配比為1∶2）。分別取油脂樣品各1 mL水浴蒸干后加入2 mL98%硫酸，混勻后置于90℃水浴中加熱20 min，取出在冰水浴中冷卻后，加入0.25 g/L香草醛磷酸溶液（0.025 g香草醛用1 mL無水乙醇溶解，再用34%磷酸定容到100 mL）3 mL，搖勻后室溫反應20 min，在526 nm處測吸光度，繪制標準曲線。菌體用無菌水洗滌兩次后適當稀釋，取1mL菌懸液，按標準曲線的制作方法測定油脂濃度，乘以稀釋倍數(shù)即得油脂產(chǎn)量[20]。

2.6.3 油脂含量測定

油脂含量/%=油脂產(chǎn)量/生物量×100

2.6.4 油脂系數(shù)測定

油脂系數(shù)=油脂產(chǎn)量/粗甘油消耗量×100

2.6.5 pH值測定

pH計預熱30 min，將電極浸入緩沖溶液進行校正，即可使用[21]。

2.6.6 殘余甘油濃度的測定

取5 mL丙三醇稀釋至50 mL，從中吸取0、0.8、1.6、2.4、3.2、4 mL 溶液分別加入 6 只比色管（10 mL）中，用含18%乙醇的飽和NaCl溶液定容，搖勻靜置；再分別從各比色管中吸取1.14 mL溶液加入6只裝有10 mL 5%NaOH和0.86 mL 15%CuSO4的小燒杯中，混勻后靜置10 min顯色，取適量溶液于8 000 r/min下離心5 min。然后取上清液，于630 nm波長下測定吸光度，并繪制標準曲線。將待測發(fā)酵液用含18%乙醇的飽和NaCl溶液適當稀釋，測其粗甘油濃度[22]。

2.7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析

采用酸熱法[23]提取油脂，油脂經(jīng)甲酯化后，利用氣相色譜對其脂肪酸組成和含量進行分析。

樣品甲酯化方法參考曲威[24]，取待測的微生物油脂0.1 g，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，于65℃水浴中皂化 30 min，加入 BF3-乙醚溶液（1 ∶1）0.2 mL，在65℃水浴中甲酯化5 min，取出，迅速冷水冷卻，加入石油醚2 mL，振蕩，靜置20 min。吸取上清液0.3μL～0.5 μL作為氣相色譜的進樣樣品。

氣相色譜檢測條件：FFAP色譜柱，進樣口270℃，檢測器270℃；柱溫：初始溫度60℃，以8℃/min升溫至185℃，保持2 min；以2℃/min升溫至260℃保持3 min；載氣：N2；柱流速：1 mL/min；分流比 20 ∶1；進樣量1 μL。使用CHEM32軟件進行數(shù)據(jù)處理。將測得的樣品色譜圖各峰的保留時間與脂肪酸標準品的保留時間作比較，確定樣品色譜圖各峰的性質(zhì)，各組分含量（P）與不飽和脂肪酸指數(shù)（IUFA）計算如下式。

IUFA=1×單烯酸含量/%+2×二烯酸含量/%+…+n×n稀酸含量/%

式中：IUFA為不飽和脂肪酸指數(shù)，%。

式中：P表示組分的相對含量，%；Ai表示組分的峰面積；∑Ai表示各組分的峰面積總和。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線繪制結(jié)果

甘油和磷酸香草醛顯色法標準曲線見圖1、圖2。

圖1 甘油標準曲線Fig.1 The standard curve of glycerin

圖2 磷酸香草醛顯色法標準曲線Fig.2 Standard curve of sulfo-phospho-vanillin reaction

由圖1可知，甘油標準曲線為y=19.386x+0.001 3，曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 5。由圖2可知，斯達油脂酵母油脂標準曲線y=3.757 7x-0.088 2，相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 1。

3.2 不同斯達油脂酵母菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生長情況

將待篩選的斯達油脂酵母菌株ZW-25、MM-17、1809、YP-07分別接種在含粗甘油培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基的平板上，25℃、培養(yǎng)5 d，每天觀察并記錄兩組平板的生長情況，結(jié)果見表1。

表1 各菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生長情況Table 1 The growth situation of different strain on crude glycerol and glucose plate

由表1可知，4株斯達油脂酵母菌株均可在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長，菌株ZW-25在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基平板上長勢良好，說明其更適合在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長。

3.3 不同斯達油脂酵母菌株以粗甘油為碳源發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究

根據(jù)2.3的方法進行試驗，各菌株利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況如圖3所示。

圖3 各菌株利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.3 The fermentation of producing lipid situation of using crude glycerol of different strain

由圖3可知，對照組中，斯達油脂酵母各菌株的生物量和油脂產(chǎn)量均高于試驗組，說明各菌株對葡萄糖的利用程度高于粗甘油。試驗組中，菌株ZW-25的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)與其它菌株相比均是最高的，分別為11.99 g/L、5.45 g/L、45.65%和17.27，但在對照組中，ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量低于1809和MM-17，說明菌株1809和MM-17對粗甘油的耐受程度低于ZW-25。故選擇斯達油脂酵母ZW-25作為后續(xù)試驗的菌株。

3.4 不同粗甘油濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

根據(jù)2.4中的方法考察粗甘油濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 斯達油脂酵母ZW-25利用不同濃度粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.4 The fermentation of producing lipid situation of using different crude glycerol concentration by Lipomyces starkeyi ZW-25

由圖4可知，斯達油脂酵母ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量隨粗甘油濃度增加而逐漸增大，當粗甘油濃度為55 g/L時，其生物量達最大值，為14.17 g/L；而油脂產(chǎn)量在粗甘油濃度為40 g/L時達最大值6.97 g/L，且其生物量高達13.79 g/L；當粗甘油濃度為70 g/L時，菌體生物量和油脂產(chǎn)量開始降低，可能是由于粗甘油的濃度過高而影響細胞的滲透壓。此外，粗甘油濃度為40 g/L時，菌株的油脂含量和油脂系數(shù)最高，分別為50.52%和18.12。故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂適宜的粗甘油濃度為40 g/L。

3.5 氮源種類和濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

根據(jù)2.4中的方法考察氮源種類和濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 斯達油脂酵母ZW-25利用不同氮源發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.5 The fermentation of producing lipid situation of using different nitrogen source by Lipomyces starkeyi ZW-25

由圖5可知，有機氮源為酵母粉時，斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的各項指標均最高，其中生物量為13.77g/L，油脂產(chǎn)量為8.22g/L，油脂含量為59.74%，油脂系數(shù)為15.02；相比之下，在以蛋白胨為有機氮源時，其各項指標略低；以尿素為有機氮源時，各項指標偏低。

對無機氮源而言，以（NH4）2SO4作為無機氮源時，斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的各項指標均最高，其中生物量為12.04 g/L，油脂產(chǎn)量為6.13 g/L，油脂含量為50.99%，油脂系數(shù)為15.01；以NH4Cl、NaNO3、NH4NO3作為無機氮源時，其各項指標偏低，以NaNO3為無機氮源時，其發(fā)酵產(chǎn)油脂各項指標最低。

故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的適宜氮源為：酵母粉+（NH4）2SO4。

3.6 不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

根據(jù)2.4中的方法考察不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，斯達油脂酵母ZW-25在低碳氮比（25～40）條件下培養(yǎng)時，菌體生長速度較快，生物量從8.91 g/L 上升至 13.79 g/L；菌株在高碳氮比（40～55）條件下培養(yǎng)時，生長速度較慢，生物量從13.79 g/L上升至14.17 g/L，但油脂產(chǎn)量較高；碳氮比為40時，油脂產(chǎn)量達6.97 g/L，說明高碳氮比利于菌株產(chǎn)油。當碳氮比大于55時，菌株的生物量和油脂產(chǎn)量逐漸減少，可能是由于粗甘油濃度過高影響細胞的滲透壓，不利于菌株生長及產(chǎn)油。故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油的適宜碳氮比為40，經(jīng)轉(zhuǎn)換可得：粗甘油濃度為40 g/L、酵母粉 0.5 g/L、（NH4）2SO42.0 g/L。

圖6 斯達油脂酵母ZW-25在不同碳氮比條件下發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.6 The fermentation of producing lipid situation under different carbon-nitrogen ratio by Lipomyces starkeyi ZW-25

3.7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程研究

根據(jù)2.5的方法對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程進行研究，結(jié)果如圖7所示。

圖7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂各指標的變化情況Fig.7 The change of different index of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

由圖7可知，斯達油脂酵母ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長呈逐漸上升趨勢，144h達最大值，分別為10.03 g/L、6.07 g/L；粗甘油濃度隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低，起始濃度從40 g/L逐漸下降至7.15 g/L；油脂含量在0～12 h上升較快，12 h達41.18%，隨后緩慢上升，到144 h達60.6%；油脂系數(shù)在0～60 h上升較快，60 h達14.12，隨后趨于平緩；隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液pH值下降趨勢明顯，0～12 h，pH值從起始的5.94下降至3.96，隨后發(fā)酵液pH值緩慢下降，到144 h下降至2.41，但在發(fā)酵期間，菌體的生長未出現(xiàn)減緩的趨勢，說明菌株對發(fā)酵液pH值的變化具有較強的耐受性。

3.8 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析

根據(jù)2.7的方法對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成進行分析，結(jié)果如圖8和表2所示。

由圖8和表2可知，斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂中含多種脂肪酸，其中含量最高的為油酸，其次是棕櫚酸，兩種脂肪酸占總脂肪酸的89.5%，由此可見其利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸為主，可作為新的油源使用。

圖8 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的氣相色譜圖Fig.8 The gas chromatogram of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

表2 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析Table 2 The fatty acid composition analysis of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

4 結(jié)論

1）通過平板培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵的方法從斯達油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07中篩選出利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的高產(chǎn)菌株ZW-25。

2）碳源和氮源對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂有較大影響，培養(yǎng)基中適宜的C/N為40，適宜的碳源氮源組成為：粗甘油濃度40 g/L，酵母粉 0.5 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L。此條件下，其生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)分別可達13.79、6.97 g/L、50.52%和18.12。

3）斯達油脂酵母ZW-25的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、油脂系數(shù)隨發(fā)酵時間的延長呈逐漸上升趨勢，144 h達最大值；粗甘油濃度隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低；隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液pH值下降趨勢明顯，但菌體生長未出現(xiàn)減緩趨勢，說明菌株對發(fā)酵液pH值的變化具有較強的耐受性。

4）斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸為主，其中油酸和棕櫚酸含量較高，分別為58.58%和30.92%，可作為功能性油脂的油源。

綜上所述，斯達油脂酵母ZW-25具有利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的應用潛力，研究結(jié)果可為粗甘油的綜合利用開辟新的途徑。