于麗娜，王明清，*，張初署，徐念均，趙玉華，畢潔，孫杰，*，龔魁杰，劉開昌，楊慶利

（1.山東省花生研究所，山東青島266100；2.西海岸現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)管委會(huì)，山東青島266000；3.膠南市種子公司，山東青島266000；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟(jì)南250000；5.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）主要是黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等曲霉產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，廣泛存在于花生、玉米、谷類等農(nóng)產(chǎn)品和食品中[1]。黃曲霉毒素是天然存在的劇毒物質(zhì)，具有致突變、致畸性、強(qiáng)致癌性，1993年被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)列為IA類致癌物質(zhì)[2]。黃曲霉毒素的基本結(jié)構(gòu)為香豆素和二呋喃環(huán)，目前已發(fā)現(xiàn)20多種，如黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）等，其中AFB1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，其毒性和致癌性最?qiáng)，AFB1毒性是氰化鉀100倍，致癌性比二甲基亞硝胺強(qiáng)75倍[3-4]。

目前對(duì)AFB1的降解方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。常用的物理法包括吸附法、輻射法和萃取法等[5]，化學(xué)法包括氨水等堿處理法、次氯酸鈉等氧化劑處理法[6]。物理法和化學(xué)法去除AFB1存在成本高、操作復(fù)雜、造成營(yíng)養(yǎng)損失、影響食品品質(zhì)等問題，而生物法具有專一性高、效率高、不破壞食品的優(yōu)點(diǎn)，是黃曲霉毒素去除的熱點(diǎn)之一。目前國(guó)內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌可以有效去除AFB1，如橙色黃桿菌（Flavobacterium aurantiacum）[7]、分支桿菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）[8]、紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）[9]、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）[10]、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[11]等菌株。目前大部分降解菌株從陸地或動(dòng)物糞便等來源中分離，從海洋中分離降解AFB1的研究較少。本研究從青島沿海的海水中分離純化能降解AFB1的菌株，豐富降解微生物種類，為AFB1的生物脫毒提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

海水樣品采自青島沿海。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品：以色列Fermentek公司；香豆素：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；色譜級(jí)甲醇：德國(guó)Merck公司；黃曲霉毒素免疫親和柱：華安麥科公司；Super GelRed熒光染色試劑：US Everbright Inc；pMD19-T載體：寶生物工程（大連）有限公司。

初篩培養(yǎng)基為香豆素液體篩選培養(yǎng)基[12]（g/L）：0.25 g KH2PO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.5 g KNO3，0.5 g（NH4）2SO4，0.005 g CaCl2，0.003 g FeCl3·6H2O，1.0 g 香豆素，pH 7.0，121℃高壓滅菌20 min。香豆素固體篩選培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g/L瓊脂。復(fù)篩培養(yǎng)基（g/L）：10 g蛋白胨，3 g牛肉膏，10 g NaCl，1 g KH2PO4，1 g葡萄糖，pH7.0，121℃高壓滅菌 15 min。LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基（g/L）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，pH7.0，121 ℃高壓滅菌 20 min。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 降解AFB1菌株的初篩

采集的海水按1/1 000接種量接種到初篩培養(yǎng)基，以香豆素為唯一碳源進(jìn)行AFB1降解菌株的初篩，100 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)15天～25天。觀察菌株的生長(zhǎng)情況，當(dāng)培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁后在初篩的固體培養(yǎng)基涂布，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，根據(jù)菌落形態(tài)等挑取單菌落，在LB固體培養(yǎng)基上多次劃線純化培養(yǎng)。純化的菌株培養(yǎng)后，加入20%甘油，-20℃冰箱保存。

1.2.2 降解AFB1菌株的復(fù)篩

初篩菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。避光條件下，980 μL 發(fā)酵菌液加入 20 μL 5 mg/kg 的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，使發(fā)酵液中AFB1終濃度為100 μg/kg，無菌復(fù)篩培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37℃避光孵育72 h。

1.3 AFB1檢測(cè)方法[13]

8 000 r/min離心20 min分離發(fā)酵液，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后過免疫親和柱，先用超純水洗兩遍，然后用色譜級(jí)甲醇洗脫，收集洗脫液。采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)溶液中AFB1的含量，HPLC檢測(cè)條件為：Agilent 1260高效液相色譜儀，C-18色譜柱（4.6 mm×15 cm×5 μm），進(jìn)樣量為 20 μL，流動(dòng)相為甲醇∶水=1∶1（體積比），流速0.8 mL/min，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm。利用以下公式計(jì)算菌株對(duì)AFB1的降解率。

式中：C代表空白對(duì)照樣品AFB1的峰面積；S代表發(fā)酵菌液處理樣品中殘留AFB1的峰面積；Y代表AFB1降解率。

1.4 菌株M8各組分降解特征研究

10 mL的菌株M8發(fā)酵液，4℃條件下8 000 r/min離心10 min，分離得到上清液和菌體。菌體用無菌蒸餾水洗滌、離心，重復(fù)3次后加入10 mL無菌蒸餾水制備成M8菌懸液。按上述方法制備10 mL菌懸液，然后在冰上超聲破碎20 min后離心，收集的液體經(jīng)0.22 μm濾膜過濾制備M8的胞內(nèi)液。將M8上清液、菌懸液、胞內(nèi)液加入AFB1，在37℃孵育72 h后，檢測(cè)各組分AFB1降解率。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 表型分析

菌株M8在LB固體培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)、色澤。

1.5.2 生理生化性質(zhì)分析

觀察菌株M8革蘭氏染色反應(yīng)，以及其能利用的碳源，其溫度耐受、鹽度耐受等試驗(yàn)[14]，氧化酶試驗(yàn)：用1%四甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽溶液浸濕濾紙，挑取新鮮的菌株A12點(diǎn)在濾紙上，在10 s內(nèi)呈現(xiàn)紫色的為陽性。

1.5.3 細(xì)菌16S rRNA基因序列測(cè)定

菌株M8接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。采用的細(xì)菌16S rRNA基因通用引物為P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，P2：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[15]。 PCR 的反應(yīng)體系 25 μL：Taq buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，Taq聚合酶 0.1 μL，引物 P1和P2 各 1 μL，M8 菌株基因組模板0.5 μL，ddH2O 17.9 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性8 min；95℃變性35 s，55 ℃退火 35 s，72℃延伸 80 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，5 μL PCR產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠，90 V電壓電泳25 min后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果，PCR產(chǎn)物送到上海生工生物有限公司測(cè)序。測(cè)序得到的序列提交到NCBI進(jìn)行BLAST分析，將目標(biāo)序列與搜索到的同源序列經(jīng)ClustalW分析后，再用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

以香豆素為唯一碳源進(jìn)行初篩，然后以加入AFB1的培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，各菌株降解AFB1的能力見圖1。

圖1 各菌株降解AFB1的能力Fig.1 The degradation of AFB1in each strain

篩選到多株能降解AFB1的菌株，其中效率最高的菌株編號(hào)為M8，孵育72 h能降解71.8%的AFB1（圖1）。下面以菌M8為對(duì)象進(jìn)行研究，分析菌株M8的降解特征并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

2.2 菌株M8降解特性

圖2為菌株M8各組分降解AFB1特性。

比較菌株M8的上清液、菌懸液、胞內(nèi)液降解AFB1的能力，發(fā)現(xiàn)上清液降解能力最強(qiáng)，達(dá)到71.8%，菌懸液和胞內(nèi)液相對(duì)較弱，分別為10.2%和6.4%。由此判斷，菌株M8降解AFB1不是依賴細(xì)菌胞體的吸附作用，而是細(xì)菌代謝產(chǎn)生并分泌至胞外的活性物質(zhì)主導(dǎo)的生物降解作用。

圖2 菌株M8各組分降解AFB1特性Fig.2 Degradation of AFB1in each component of strain M8

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株M8形態(tài)學(xué)特征

菌株M8的菌落形態(tài)見圖3。

圖3 菌株M8的菌落形態(tài)Fig.3 The colony morphology of strain M8

由圖3菌株M8的菌落形態(tài)可以看出，菌株M8在LB培養(yǎng)基上單菌落呈現(xiàn)圓形，淡黃色，不透明，2 mm～3 mm直徑。

2.3.2 菌株M8生理生化特征

菌株M8的革蘭氏染色呈陰性，能利用吐溫20、吐溫80、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖等碳源，具有氧化酶活性，能耐受6%的鹽度，能在4℃～40℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)（表1）。

表1 菌株M8的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characteristics of stain M8

2.3.3 菌株M8的16S rRNA基因鑒定

菌株M8的16S rRNA基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4，菌株M8的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

以16S rRNA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 000 bp～2 000 bp之間獲得一條特異性的擴(kuò)增條帶，且條帶清晰亮度好（圖4）。經(jīng)測(cè)序得到16S rRNA基因長(zhǎng)度為1 498 bp，與已經(jīng)公布的序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株M8與假單胞菌屬（Pseudomonas）的菌株處于同一大的分支，其中與菌株P(guān)seudomonaskoreensisPs9-13T[16]的進(jìn)化距離最近，相似度超過99%（圖5）。結(jié)合形態(tài)、生理生化和16S rRNA基因分析結(jié)果鑒定菌株M8為假單胞菌屬，命名為Pseudomonas sp.M8。

圖4 菌株M8的16S rRNA基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Electrophoresis profile of 16S rRNA gene from srain M8 by PCR

圖5 菌株M8的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain M8 based on 16S rRNA gene sequences

3 討論與結(jié)論

有關(guān)AFB1降解菌的篩選已有較多報(bào)道，大部分研究是從陸地土壤和動(dòng)物糞便等樣品中分離降解菌株。海洋中細(xì)菌種類繁多、代謝產(chǎn)物豐富多樣并且不同于陸地生物，從海洋樣品中分離能降解AFB1的菌株，將豐富降解AFB1的菌種資源。本研究從海水中分離到多株能降解AFB1的菌株，其中菌株M8的降解率較高，進(jìn)一步分析了M8各個(gè)組分的降解特征，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌分泌的活性物質(zhì)降解AFB1。前期研究發(fā)現(xiàn)有的菌種脫除AFB1的機(jī)理是吸附作用，如有的乳酸菌和酵母等菌株通過菌體吸附作用吸附毒素形式菌體-AFB1復(fù)合物，但是該復(fù)合物是可逆的，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化AFB1可能會(huì)再次釋放到機(jī)體中，因而這種毒素的去除是可逆的[17-18]。本研究分離菌株M8的AFB1去除不是吸附作用，在后續(xù)分離純化AFB1的胞外活性物質(zhì)時(shí)，排除了細(xì)胞菌體和胞內(nèi)產(chǎn)物對(duì)生物工程下游處理帶來的不便和復(fù)雜程序。

本研究從海水樣品中篩選出的菌株M8能高效降解AFB1，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)起降解的活性物質(zhì)主要位于細(xì)菌胞外液。根據(jù)細(xì)菌生物形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rRNA基因分析鑒定菌株M8為假單胞菌，命名為Pseudomonas sp.M8。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究該菌的降解機(jī)理及應(yīng)用于AFB1脫毒奠定了基礎(chǔ)。