石振鵬，吳子健，*，劉敏堯，劉靚

（1.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134；2.天津濱海諾奧酶工程技術(shù)有限公司，天津300300）

花生不僅富含油脂（其脂肪含量約為45%～56%）， 還富含蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)含量為22%～30%）[1]，是生產(chǎn)食用油重要的原料，也是重要的食品原料、以及食品添加劑、風味劑等，其已經(jīng)被廣泛應用于人們?nèi)粘Ｊ称返纳a(chǎn)與加工中[2-4]。然而，攝食花生或含花生的食品會導致眾多花生過敏者嚴重甚至是致命的過敏反應，由其誘發(fā)的過敏反應為速發(fā)型，通常過敏者在攝入半小時后就會產(chǎn)生過敏，危害程度很高。2002年Bindslev-Jensen C等利用統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)牛奶、雞蛋和大豆粉引起過敏反應的閾劑量（即1百萬過敏者發(fā)生1例過敏的食物劑量）分別為 0.005、0.002、0.001 3 mg，而花生粉僅為0.000 7 mg[3]。在美國，約0.8%的兒童以及0.6%的成年人對花生過敏[4]。而我國民眾食用花生的量不斷提高，因而花生過敏反應的比例也在不斷增加。目前已知的花生過敏原（分別為Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7、Ara h8、Ara h9、Ara h10和Ara h11）是一類分子量在0.7 kDa～100 kDa的糖蛋白[5]，其中 Ara h1（63.5 kDa）和 Ara h2（16 kDa～17 kDa）是最主要的兩種，分別占花生總蛋白的12%～16%和5.9%～9.3%，90%的花生過敏癥患者對這兩種蛋白過敏[6]。2006年Kagan等研究表明約75%花生過敏反應是由意外接觸引起的，進而危及生命，占已報道與過敏相關死亡的59%[7]。因此消減花生、花生制品及其原料中過敏原至關重要，不僅可有效防止過敏，并且可以提高過敏者的生活質(zhì)量，更可保護過敏者的生命安全。

目前，消減花生過敏原的方法包括熱處理[8]、輻射處理[9]、酶法[10]以及基因工程法[11]。其中酶法是通過修飾或破壞花生抗原決定簇，進而降低其過敏性，是目前較為有效且安全的處理方式。2007年叢艷君[12]研究發(fā)現(xiàn)脫殼烘烤后的花生中所提取的蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶Alcalase酶解，其花生蛋白致敏性降低了34.5%。2006年尤麗麗[13]研究發(fā)現(xiàn)利用胰蛋白酶水解可有效將花生乳的致敏性降低61.6%。

本文通過采用復合蛋白酶制劑消減花生過敏原性的方法，將預處理過的花生仁漿通過控制酶用量，酶解時的pH值，溫度以及時間來確定最佳消減花生過敏原性的工藝手法，消減情況通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附（enyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生：市售；食品級堿性蛋白酶（200 000 U/g）、中性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（8 000 000 U/g）和風味酶（40 000 U/g）：天津諾奧酶科技發(fā)展有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒：北京百泰克生物技術(shù)有限公司；花生過敏原Ara h1酶聯(lián)免疫分析試劑盒、花生過敏原Ara h2酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海酶聯(lián)生物研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；試驗所用超純水均為天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院實驗室自制。

1.2 主要儀器和設備

3-18K低溫高速離心機：美國Sigma公司；KQ-500B超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；SpectraMax190光吸收酶標儀：美國美谷分子儀器有限公司；UPT-11-20T超純水器：成都優(yōu)普超純科技有限公司；FiveEasy PlusTMpH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；FDU-810型EYELA冷凍干燥機：日本東京理化公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生仁漿的預處理

取100 g脫殼花生仁經(jīng)過研磨，加入100 mL蒸餾水打漿，然后沸水浴30 min，作為酶解底物。

1.3.2 復合酶酶解花生仁漿

將預處理好的花生仁漿中加入一定濃度的復合蛋白酶制劑溶液，調(diào)節(jié)其反應pH值，置于已調(diào)至所需酶解溫度的恒溫水浴箱內(nèi)，酶解一定時間。然后提取蛋白并以ELISA法測定其過敏原性。

1.3.2.1 復合蛋白酶制劑的最佳配比優(yōu)化

參考相關資料[12-13]，初定酶解條件為酶用量2%，pH值7.0，酶解溫度55℃，酶解4 h。

選用堿性蛋白酶（Alcalase，A）、中性蛋白酶（Neutrase，N）、木瓜蛋白酶（Papain，P）、風味酶（Flavorzyme，F(xiàn)）按照不同的體積比例的復合，其中以前3種酶為主。設置復配比例如下：

復合酶樣品 1：A∶N∶P∶F=2∶1∶1∶1；復合酶樣品 2：A∶N∶P∶F=1∶2∶1∶1；復合酶樣品 3：A∶N∶P∶F=1∶1∶2∶1；復合酶樣品 4：A∶N∶P∶F=2∶2∶1∶1；復合酶樣品 5：A∶N∶P∶F=2∶1∶2∶1；復合酶樣品 6：A∶N∶P∶F=1∶2∶2∶1；復合酶樣品 7：A∶N∶P∶F=2∶2∶2∶1。

1.3.2.2 酶用量的優(yōu)化

5份樣品的復合蛋白酶制劑用量分別為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。

1.3.2.3 pH值的優(yōu)化

5 份樣品的 pH 值參數(shù)分別為：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

1.3.2.4 酶解溫度的優(yōu)化

5 份樣品的溫度參數(shù)分別為：45、50、55、60、65 ℃。

1.3.2.5 酶解時間的優(yōu)化

5 份樣品的酶解時間參數(shù)分別為：3、3.5、4、4.5、5 h。

1.3.2.6 酶解正交試驗

在以上條件下所測得結(jié)果中，選擇合適的參數(shù)進行正交試驗分析，確定最佳方案。

1.3.3 花生蛋白的提取

將花生仁漿冷凍干燥后按10 mL/g的比例加入正己烷，于4℃振蕩過夜脫脂，然后4℃離心（8 000 r/min，離心20 min），取沉淀凍干得脫脂花生粉。

參考Prakash等[14]的方法：將脫脂花生粉，按1∶20（g/mL）比例加入pH值為7.8的20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（含1 mol/L氯化鈉），4℃振蕩提取4 h，然后于4℃離心（14 000 r/min，離心10 min），取上清液，4℃透析（透析袋分子截留量為8 kDa～10 kDa）48 h之后凍藏備用。

1.3.4 蛋白濃度的測定

采用二辛可寧酸法（bicinchoninic acid，BCA）[15]測定花生蛋白溶液的濃度。

1.3.5 酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）

使用Ara h1及Ara h2酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒測定兩種過敏原的濃度及消減情況，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合蛋白酶制劑的配比試驗結(jié)果

堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復配使用進行花生漿的酶解克服了花生過敏原對于單一酶的抑制作用。各種酶的降解底物存在差異，將幾種酶復配使用，各自的差異特性會產(chǎn)生協(xié)同增效作用，提高酶的催化活性。而添加風味酶能有效的改善因蛋白降解而引起的味道不適，增加酶解后花生漿的口感。7種復合酶樣品酶解后Ara h1及Ara h2消減率變化如圖1所示。

圖1 復合蛋白酶比例對花生蛋白致敏性消減率的影響Fig.1 Effect of the ratio complex enzyme on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖1可知，樣品1～3為分別單獨增加前3種酶的用量是，花生致敏蛋白消減率的變化，此時致敏蛋白消減率為1＞2＞3，即堿性蛋白酶對致敏蛋白的消減作用強于中性蛋白酶及木瓜蛋白酶；由樣品4～6可知，同時增加兩種酶在復合酶中的配比，致敏蛋白消減效果最好的為樣品4，Areh1消減率為90.21%，Areh2消減率為88.33%；樣品7為增加了3種酶在復合酶的配比，Areh1消減率90.36%，Areh2消減率87.45%，與樣品4相比，復合酶制備成本增加，但效果提升不明顯，故選用A∶N∶P∶F=2∶2∶1∶1作為復合蛋白酶制劑的較優(yōu)配比。

2.2 復合蛋白酶制劑的酶解條件單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶用量對花生蛋白致敏性的影響

圖2為酶用量對酶解后Arah1及Arah2消減率變化的影響。

圖2 酶用量對花生蛋白致敏性消減率的影響Fig.2 Effect of the enzyme dosage on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖2可知，隨著酶用量的增加，花生致敏蛋白消減率呈增長趨勢，當酶液濃度達到3%后，其消減花生蛋白過敏原性效果趨于平緩。這表明酶與底物的作用達到了平衡，繼續(xù)增加酶量造成了成本的浪費。因此，選用3%為最適酶用量。

2.2.2 酶解pH值對花生蛋白致敏性的影響

復合蛋白酶制劑為多種酶的混合，需綜合考慮各種酶的適用pH值范圍，以確定最佳酶解條件。酶解pH值對Arah1及Arah2消減率變化的影響如圖3所示。

圖3 pH值對花生蛋白酶解致敏性消減率的影響Fig.3 Effect of the hydrolysis pH on the reducing allergenic property of peanut protein

pH值對復合蛋白酶制劑酶解花生蛋白的效率影響較大，由圖3可知，當pH值為7.5時，花生致敏蛋白消減率最高，Ara h1消減率為90.96%，Ara h2消減率為88.33%，此時仍處于堿性蛋白酶，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的最適pH值范圍內(nèi)，由于風味酶的主要作用在于改善花生仁漿的風味，且此pH值下風味酶的活性保持較好，故可選取7.5為最適酶解pH值。

2.2.3 酶解溫度對花生蛋白致敏性的影響

酶解溫度的選擇與pH的選擇類似，酶解溫度對Ara h1及Ara h2消減率變化的影響如圖4所示。

圖4 酶解溫度對花生蛋白的致敏性的影響Fig.4 Effect of the hydrolysis temperature on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖4可知，在60℃時復合蛋白酶制劑消減花生過敏原性效果最好，Ara h1消減率91.22%，Ara h2消減率88.67%。此溫度下各種酶類仍能保持較高的活性狀態(tài)，且當酶解溫度較高時，有利于花生中油脂與食物蛋白的擴散，可以一定程度上加快酶解速度。這符合蘆鑫等[16]的解釋：最適酶解溫度實際上是溫度對酶活性和食物蛋白及油脂的擴散度影響。故確定最適酶解溫度為60℃。

2.2.4 酶解時間對花生蛋白致敏性的影響

酶解時間對Ara h1及Ara h2消減率變化的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解時間對花生蛋白致敏性的影響Fig.5 Effect of the hydrolysis time on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖5可知，酶解時間為4 h時，Ara h1消減率91.59%，Ara h2消減率89.15%，隨著時間的繼續(xù)增加，致敏蛋白消減率變化不是很大，考慮到時間成本，最適酶解時間為4 h。

2.3 復合蛋白酶制劑的酶解正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用酶解時間、pH值、酶用量以及酶解溫度，以Ara h1和Ara h2的平均消減率為指標進行L9（34）正交試驗。正交試驗表及極差分析結(jié)果如表1所示。

表1 復合蛋白酶制劑酶解正交試驗及極差分析表Table 1 Orthogonal test and range analysis of enzymatic hydrolysis of compound enzyme

從正交試驗驗表得知9組試驗中花生致敏蛋白消減率的較好方案為A3B1C3D2，由極差分析得出影響復合蛋白酶制劑酶解花生蛋白水解物致敏性的因素主次關系為C＞D＞B＞A，即花生致敏蛋白消減率最佳條件組合為A2B1C3D2，與較好方案不一致，因此需進一步進行驗證試驗，試驗結(jié)果如表2。

表2 復合蛋白酶制劑酶解驗證試驗Table 2 Complex enzyme preparation enzymatic verification test

由表2可知A2B1C3D2為復合蛋白酶制劑消減花生致敏性蛋白的最佳條件，在此條件下通過ELISA試驗計算得到Ara h1消減率94.06%，Ara h2消減率91.75%。上述試驗僅以花生致敏蛋白中最主要的兩種Ara h1和Ara h2的消減率代表了花生致敏蛋白消減率，關于該種復合蛋白酶制劑對于其他非主要種類的致敏蛋白的消減率的測定需進一步的試驗研究。

3 結(jié)論

得到一種復合蛋白酶制劑可有效地消減花生仁漿中Ara h1和Ara h2，各種酶的配比為，堿性蛋白酶∶中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶∶風味酶的體積比為 2∶2∶1∶1。正交試驗優(yōu)化了復合蛋白酶制劑消減花生仁漿中Ara h1和Ara h2的水解條件：酶用量4%，酶解溫度60℃，pH值7.0，酶解時間4 h。在該條件下處理所得的花生仁漿中的致敏蛋白Ara h1和Ara h2的平均消減率為92.91%