（吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130507）

糙米營(yíng)養(yǎng)豐富，但由于保留了富含纖維質(zhì)的米糠層，使其口感較差、不易消化，嚴(yán)重限制了其銷(xiāo)量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，糙米經(jīng)發(fā)芽后，食用品質(zhì)改善、化學(xué)成分改變[2]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值會(huì)明顯提高[3]，同時(shí)會(huì)富集一些功能性營(yíng)養(yǎng)成分[4-5]，尤其是對(duì)人體具有生理調(diào)節(jié)功能的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），其含量是糙米的3 倍，大米的 10 倍[2，6]。

GABA是一種天然存在的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，因具有改善腦機(jī)能、降血壓、抗衰老、促進(jìn)長(zhǎng)期記憶以及預(yù)防消化道癌癥等多種保健功能，近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[7-8]。研究表明，植物中的GABA合成轉(zhuǎn)化途徑有兩條，谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）分別為這兩條途徑合成GABA的關(guān)鍵酶[9]，其中GAD起主導(dǎo)作用。當(dāng)植物受到冷激、熱激、干旱、低氧脅迫、酸脅迫及鹽脅迫等逆境脅迫時(shí)，會(huì)強(qiáng)烈刺激兩種酶的活性，從而使GABA大量富集[10]，其中鹽脅迫法簡(jiǎn)單易行，且安全環(huán)保[11]。GAD是一種Ca2+/鈣調(diào)節(jié)依賴(lài)型酶，具有一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)[12]。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在植物籽粒發(fā)芽期間，施用Ca2+有助于GABA富集[13-14]。目前，鹽脅迫[1]、低氧脅迫[15]、低溫脅迫[16-17]對(duì)發(fā)芽糙米富集GABA的影響已有研究，而對(duì)NaCl脅迫聯(lián)合Ca2+處理下，優(yōu)化培養(yǎng)條件富集糙米GABA的研究還鮮有報(bào)道。

本文采用NaCl脅迫聯(lián)合Ca2+處理的方式培養(yǎng)糙米發(fā)芽，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化了發(fā)芽糙米富集GABA的工藝條件，研究了NaCl濃度、Ca2+濃度、發(fā)芽溫度及發(fā)芽時(shí)間4個(gè)因素對(duì)GABA富集的影響，以期為糙米的開(kāi)發(fā)利用及富含GABA健康食品的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米：品種為龍粳31，產(chǎn)自黑龍江?。籊ABA標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：Sigma試劑公司；其他試驗(yàn)試劑均為分析純；試驗(yàn)用水均為三級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-250HC-I型恒溫恒濕箱、DHG-9245A型鼓風(fēng)干燥箱、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JXFM110型錘式旋風(fēng)磨：杭州大吉光電儀器有限公司；N2型分光光度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LE204E型分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-10C型高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 糙米發(fā)芽處理

選取籽粒飽滿(mǎn)、成熟度高、無(wú)裂痕的糙米粒，每份10.0 g，蒸餾水沖洗3遍，浸泡于1%的次氯酸鈉溶液中滅菌10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次后濾干。加入10倍體積的一定濃度的NaCl和CaCl2混合溶液，30℃下浸泡12 h，取出后均勻的攤于鋪有濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中，蓋上紗布，其中紗布已用NaCl和CaCl2混合溶液潤(rùn)濕，轉(zhuǎn)入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中，每隔4小時(shí)均勻噴灑2 mL NaCl和CaCl2混合溶液。培養(yǎng)結(jié)束后，用蒸餾水清洗3遍，放入45℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎后即為發(fā)芽糙米粉，過(guò)80目篩，于4℃保存，備用。

1.3.2 發(fā)芽糙米中GABA含量的測(cè)定

采用Berthelot法測(cè)定發(fā)芽糙米中的GABA。準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g發(fā)芽糙米粉，蒸餾水定容至10 mL，超聲提取2小時(shí)后，3 000 r/min離心15 min，上清液中吸取400μL置于微量離心管中，加入600 μL pH=9.0硼酸緩沖溶液，混勻后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的重蒸苯酚溶液2 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的次氯酸鈉溶液1 mL，振蕩混勻。沸水浴中煮沸10 min，迅速取出，置于冰浴中冷卻20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液，630 nm處測(cè)定溶液吸光度值[18]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以NaCl溶液濃度、Ca2+溶液濃度、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間為試驗(yàn)考察因素，以GABA為考察指標(biāo)，確定各因素對(duì)GABA富集量的影響。

表1 糙米發(fā)芽試驗(yàn)方案Table 1 Design of experiment of germinated brown rice

1.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Design-Expert 10.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以GABA含量為指標(biāo)，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合優(yōu)化出最佳富集GABA的工藝條件。試驗(yàn)自變量因素編碼及水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels used in response surface experiments

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaCl溶液濃度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

NaCl溶液濃度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1NaCl溶液濃度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.1 Effect of sodium chloride concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖1所示，不同濃度的NaCl溶液對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。NaCl溶液濃度低于10 mmol/L時(shí)，GABA含量隨著NaCl溶液濃度的增加而增大。這是由于NaCl溶液在一定濃度范圍內(nèi)會(huì)造成植物處于鹽脅迫逆境，從而促進(jìn)GABA生成[19]。當(dāng)NaCl溶液濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，發(fā)芽糙米中GABA含量達(dá)到最大值，為101.82 mg/100 g，為未添加NaCl組（84.04 mg/100 g）的 1.21倍，此后，隨著 NaCl溶液濃度增大，GABA含量呈減小趨勢(shì)。

2.2.2 Ca2+溶液濃度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

Ca2+溶液濃度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 Ca2+溶液濃度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.2 Effect of Ca2+concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖2所示，不同濃度的Ca2+溶液對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響具有顯著性差異（P＜0.05）。Ca2+濃度在0～40 mmol/L時(shí)，發(fā)芽糙米GABA含量隨著Ca2+濃度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。這是由于添加Ca2+可提高GAD的活力[20]。當(dāng)Ca2+溶液在20mmol/L時(shí)，GABA含量最高，為106.25 mg/100 g，為未添加Ca2+組（77.37 mg/100 g）的1.37倍。這表明在糙米發(fā)芽過(guò)程中，添加適當(dāng)濃度的Ca2+溶液有助于富集GABA。

2.2.3 發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.3 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

如圖3所示，發(fā)芽溫度對(duì)糙米發(fā)芽富集GABA具有顯著性差異（P＜0.05）。發(fā)芽糙米的GABA主要是由發(fā)芽期間，糙米的胚芽所產(chǎn)生的[21]。當(dāng)浸泡溫度較低時(shí)，不利于糙米發(fā)芽。隨著溫度的升高，糙米發(fā)芽速度變快，同時(shí)GAD的活性也隨著溫度的提高而升高。當(dāng)發(fā)芽溫度在30℃時(shí)，GABA含量最高，為104.46 mg/100 g。隨著溫度的上升，GAD的活性受到抑制，導(dǎo)致GABA含量降低。因此，糙米發(fā)芽最適溫度為30℃。

2.2.4 發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量的影響Fig.4 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

如圖4所示，在1 d～2.5 d之間，隨著發(fā)芽時(shí)間的增加，GABA含量明顯增加，表明發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA含量具有顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)發(fā)芽2.5 d時(shí)，GABA含量為115.39 mg/100 g。發(fā)芽時(shí)間超過(guò)2.5 d時(shí)，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA富集速度明顯變慢，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間為3 d時(shí)，GABA含量為115.80 mg/100 g，與2.5 d沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），并且發(fā)芽時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，GABA會(huì)在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，轉(zhuǎn)換成琥珀酸半醛，從而使GABA含量下降[22]。同時(shí)，發(fā)芽時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)，糙米發(fā)生霉變，品質(zhì)下降。綜合考慮，發(fā)芽時(shí)間為2.5 d較為適宜。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化糙米發(fā)芽工藝條件

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert軟件，以 NaCl溶液濃度（X1）、Ca2+溶液濃度（X2）、發(fā)芽溫度（X3）和發(fā)芽時(shí)間（X4）作為自變量，以GABA含量為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experiments design and results of Box-Behnken

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert軟件進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立了GABA（Y）二次響應(yīng)面回歸模型，擬合的二次多項(xiàng)式方程為：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4-0.30X2X3+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56X22-20.36X32-15.07X42。

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 發(fā)芽糙米GABA富集條件優(yōu)化回歸模型顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test for the regression equation of optimal GABA accumulation conditions in germinated brown rice

該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.992 6，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.985 1，表明所建立的模型能解釋98.51%響應(yīng)值的變化，可以用此模型對(duì)糙米發(fā)芽富集GABA試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。X1、X2、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32及 X42均對(duì) GABA 含量具有極顯著影響（P＜0.01），X3和 X4對(duì) GABA 含量具有顯著影響（P＜0.05）。X2X3對(duì)GABA含量影響不顯著（P＞0.05）。四因素對(duì)GABA 含量的影響順序?yàn)?X1＞X2＞X3＞X4。剔除不顯著項(xiàng)，擬合方程修訂為：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56 X22-20.36X32-15.07X42。

圖5為GABA含量的實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3，表明兩者之間的相關(guān)性極好。綜上所述，所建立模型能很好的對(duì)GABA含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖5 發(fā)芽糙米GABA含量實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性Fig.5 Correlation between predicted and observed values of GABA content in germinated brown rice

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖6 NaCl溶液濃度（X1）和 Ca2+溶液濃度（X2）響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.6 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and Ca2+concentration（X2）

圖7 NaCl溶液濃度（X1）和發(fā)芽溫度（X3）響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination temperature（X3）

圖8 NaCl溶液濃度（X1）和發(fā)芽時(shí)間（X4）響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.8 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination time（X4）

圖9 Ca2+溶液濃度（X2）和發(fā)芽溫度（X3）響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.9 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination temperature（X3）

圖10 Ca2+溶液濃度（X2）和發(fā)芽時(shí)間（X4）響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.10 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination time（X4）

圖6～圖11為根據(jù)線(xiàn)性回歸模型繪制的響應(yīng)面及其等高線(xiàn)圖。根據(jù)此結(jié)果可以直觀分析因素間的交互作用對(duì)GABA含量的影響。響應(yīng)面越陡峭，表明該試驗(yàn)條件的改變對(duì)GABA含量影響越大[23]。從響應(yīng)面圖可以看出，4個(gè)因素所形成的坡度都比較陡峭，尤其是X1和X2兩個(gè)因素更為陡峭，表明NaCl濃度和Ca2+濃度對(duì)GABA含量的影響較其余兩個(gè)因素要大。4個(gè)因素的變化趨勢(shì)均為先增大后降低，6個(gè)響應(yīng)面均存在一個(gè)極大值點(diǎn)。等高線(xiàn)的性狀反應(yīng)了因素間的交互作用的強(qiáng)弱，等高線(xiàn)呈橢圓形，表明兩個(gè)因素的交互作用顯著，呈圓形，則表明兩個(gè)因素的交互作用不顯著[24]。除圖9外，5個(gè)等高線(xiàn)圖均呈橢圓形，表明除Ca2+濃度和發(fā)芽溫度交互作用不顯著外，其余各兩因素間交互作用顯著。這一結(jié)果與顯著性分析結(jié)論相符。

圖11 發(fā)芽溫度（X3）和發(fā)芽時(shí)間（X4）響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.11 Response surface and contour polt showing the effects of germination temperature（X3）and germination time（X4）

2.2.4 最優(yōu)條件的確定及驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到糙米發(fā)芽富集GABA的最佳工藝條件為NaCl溶液濃度為7.390 mmol/L，Ca2+溶液濃度為14.940 mmol/L，發(fā)芽溫度為28.829℃，發(fā)芽時(shí)間為2.298 d，預(yù)測(cè)發(fā)芽糙米GABA含量為145.29 mg/100 g。根據(jù)實(shí)際操作條件，將富集工藝調(diào)整為NaCl溶液濃度為7.50 mmol/L，Ca2+溶液濃度為15.0 mmol/L，發(fā)芽溫度為29℃，發(fā)芽時(shí)間為2.3 d。在此條件下進(jìn)行糙米發(fā)芽富集GABA，作6次平行試驗(yàn)，得GABA平均含量為144.98 mg/100 g。預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相對(duì)誤差較小，說(shuō)明所建立的模型具有較好的準(zhǔn)確性及可靠性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以GABA含量為指標(biāo)，采用Design-Expert軟件應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行四因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)。方差分析結(jié)果表明NaCl濃度和Ca2+濃度對(duì)GABA含量具有極顯著性影響；NaCl濃度和Ca2+濃度、NaCl濃度和發(fā)芽溫度、NaCl濃度和發(fā)芽溫度、Ca2+濃度和發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間的交互作用對(duì)GABA含量具有極顯著性影響；發(fā)芽溫度和發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA含量具有顯著性影響；Ca2+濃度和發(fā)芽溫度的交互作用對(duì)GABA含量無(wú)顯著性影響。由回歸方程得出，當(dāng)NaCl濃度為7.390 mmol/L，Ca2+溶液濃度為14.940 mmol/L，發(fā)芽溫度為28.829℃，發(fā)芽時(shí)間為2.298 d時(shí)，發(fā)芽糙米GABA含量最大，預(yù)測(cè)值為145.29 mg/100 g?？紤]到實(shí)際操作的可行性，最后優(yōu)化的富集條件為NaCl濃度為7.50 mmol/L，Ca2+濃度為15.0 mmol/L，發(fā)芽溫度為29℃，發(fā)芽時(shí)間為2.3 d。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明所建立的回歸模型可較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)發(fā)芽糙米GABA含量，通過(guò)優(yōu)化，可有效提高GABA含量，具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。