范晶晶，李 煒，呂釗旭，馮永珍，鄭秋闿

(1.濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濰坊 261061；2.山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261061；3.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院內(nèi)科教研室，山東濰坊261041；4.山東省濰坊市婦幼保健院新生兒科 261000；5.濰坊學(xué)院校醫(yī)院護(hù)理部，山東濰坊 261061；6.濰坊學(xué)院化學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院，山東濰坊 261061)

半胱亞磺酸脫羧酶(cysteine sulfinate decarboxylase,CSD)對(duì)底物半胱亞磺酸具有較高親和性，是?；撬岷铣傻南匏倜竅1]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)?；撬岷铣傻牡谝徊绞怯傻鞍彼岷桶腚装彼峤?jīng)代謝產(chǎn)生半胱亞磺酸，然后半胱亞磺酸經(jīng)過(guò)CSD的脫羧作用形成亞?；撬幔俳?jīng)氧化最終生成?；撬醄2]。研究發(fā)現(xiàn)?；撬崾禽斅压芤褐兴阶罡叩挠坞x氨基酸，在小鼠輸卵管液中可達(dá)到6.64 μmol/L，能占總游離氨基酸的59%[3]，在妊娠第二天大鼠輸卵管液中濃度達(dá)101.8 μmol/L[4]。輸卵管是胚胎早期發(fā)育的主要場(chǎng)所，許多研究結(jié)果已證實(shí)?；撬岽_實(shí)參與調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和胚胎的著床。在培養(yǎng)液中添加一定量的?；撬崮艽龠M(jìn)小鼠、大鼠、兔、牛和人等多種動(dòng)物胚胎的體外發(fā)育[4-8]。但是目前早期胚胎是否表達(dá)CSD，胚胎能否通過(guò)CSD的作用來(lái)自身合成牛磺酸滿足發(fā)育的需要，至今仍無(wú)詳細(xì)的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、免疫熒光染色的方法，研究分析牛磺酸、CSD基因及蛋白在小鼠早期胚胎中的表達(dá)情況，進(jìn)而為CSD和?；撬嵩谂咛ピ缙诎l(fā)育功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑 10周齡雌、雄昆明(KM)品系小鼠(購(gòu)自青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK(魯)20130010)，自由飲水采食，溫度控制在22～26 ℃，14 h光照，10 h黑暗。小鼠超數(shù)排卵和早期各發(fā)育階段胚胎的收集方法按照范晶晶[9]的描述進(jìn)行。Trizol RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)，孕馬血清激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG，寧波第二激素廠)，F(xiàn)ITC標(biāo)記鏈霉親和素(SP-FITC，美國(guó)Southern Biotech公司)，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(GARB)、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(GAR-FITC，Zymed公司)，?；撬嵋豢?德國(guó)Merck公司)，CSD一抗是由法國(guó)TAPPAZ教授(Directeur de Recherche CNRS,INSERM U 433,法國(guó))贈(zèng)送。其余試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。主要儀器有高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Imager公司)，TE2000-E激光共聚焦掃描顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2RT-PCR 分別收集各發(fā)育時(shí)期100枚胚胎于500 μL的Trizol RNA裂解液中，按照說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取3 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加至PCR反應(yīng)體系中，引物各1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶1 μL，H2O 35 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 10 min。CSD上游引物為5′-GTT TGG GAT TGT TGT AGA TGA-3′，下游引物為5′-GTG TAC TGG CTA GTG TTG AGG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為279 bp(登錄號(hào) NM_144942)。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，上游引物為5′-ATG AGG TAG TCT GTC AGG T-3′，下游引物為5′-ATG GAT GAC GAT ATC GCT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為569 bp(登錄號(hào)X03672)。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，Alpha Imager凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，Alpha Imager 2200 軟件分析PCR電泳條帶的光密度值。

1.3免疫熒光染色 取2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚、囊胚期胚胎用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，然后轉(zhuǎn)移到載玻片上，晾干后迅速用-20 ℃預(yù)冷的固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)固定30 min。封閉液(0.2%Triton X-100、10%正常羊血清的PBS)封閉2 h，加入CSD一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日PBS洗3次，每次5 min，加入GARB(1∶200)在常溫下育孵2 h，然后用PBS洗滌，加入SP-FITC(1∶50)常溫下孵育2 h，再用上述方法進(jìn)行洗滌，用Hoechst33342復(fù)染2 min。另外一部分固定好的胚胎封閉后加入?；撬嵋豢?1∶1 000)，4 ℃下孵育過(guò)夜，加入GAR-FITC(1∶200)在常溫下育孵2 h，加入碘化丙啶(PI)(1∶200)復(fù)染2 min，用1,4-二疊氮雙環(huán)[2.2.2]辛烷(DABCO)封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR結(jié)果 CSD mRNA在2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚、囊胚期的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，著床前不同時(shí)期小鼠胚胎都有CSD mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與預(yù)期的大小一致，約279 bp，β-actin約569 bp。CSD mRNA在小鼠著床前胚胎中的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度顯示，胚胎從2-細(xì)胞期開(kāi)始到囊胚期CSD mRNA表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)，桑葚胚表達(dá)量急劇升高，囊胚期達(dá)到最高值。見(jiàn)圖1。

A：PCR凝膠電泳圖；B：PCR分析圖。1:DNA分子標(biāo)記物;2:2-細(xì)胞期;3:4-細(xì)胞期;4:8-細(xì)胞期;5:桑葚胚期;6:囊胚期；a:P<0.95，與2-細(xì)胞期比較；b:P<0.05,與4-細(xì)胞期比較；c:P<0.05,與8-細(xì)胞期比較；d:P<0.05,與桑葚胚期比較

圖1 RT-PCR檢測(cè)CSD mRNA在早期胚胎

發(fā)育各階段的表達(dá)

圖2 CSD蛋白在小鼠早期胚胎發(fā)育各階段的表達(dá)(免疫熒光染色)

A:2-細(xì)胞期;B:4-細(xì)胞期;C:8-細(xì)胞期;D:桑葚胚期;E:囊胚期

圖3牛磺酸在小鼠早期胚胎發(fā)育各階段的表達(dá)(免疫熒光染色)

2.2免疫熒光染色結(jié)果 CSD蛋白免疫熒光染色結(jié)果顯示，從2-細(xì)胞至囊胚期均呈陽(yáng)性綠色熒光，熒光亮度逐漸增強(qiáng)。CSD均勻分布在卵裂球細(xì)胞質(zhì)中，晚期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞都為陽(yáng)性著色，透明帶無(wú)著色，見(jiàn)圖2。?；撬崦庖邿晒馊旧Y(jié)果顯示，從2-細(xì)胞期至囊胚期的整個(gè)發(fā)育過(guò)程細(xì)胞質(zhì)均呈陽(yáng)性綠色熒光，透明帶無(wú)陽(yáng)性，見(jiàn)圖3。

3 討 論

小鼠妊娠期短、繁殖力強(qiáng)多被用來(lái)研究胚胎的發(fā)育。哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜有序的調(diào)控過(guò)程，任何因素異常都有可能導(dǎo)致發(fā)育失敗[10]。?；撬崾钦{(diào)節(jié)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)功能的重要活性物質(zhì)[11-12]。近年研究發(fā)現(xiàn)在雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)含量豐富，對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的促進(jìn)作用[13]。例如可提高受精卵的發(fā)育速度[4]，顯著提高胚胎2-細(xì)胞率、囊胚率、囊胚總細(xì)胞數(shù)[5,14]。?；撬岽龠M(jìn)胚胎發(fā)育的機(jī)制主要有：(1)調(diào)節(jié)滲透壓穩(wěn)定細(xì)胞膜[15]；(2)可以抑制氧化性毒素物質(zhì)的產(chǎn)生，并通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體活性起到抗氧化作用[16]；(3)有類(lèi)胰島素樣作用，能促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]；(4)可以抑制Na+，K+-ATP酶活性，避免細(xì)胞內(nèi)K+水平異常升高所造成胚胎的損傷等[18]。

CSD在嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的活性較高，其自身合成的牛磺酸足以滿足生理需要。CSD基因敲除后，第二代(G2)小鼠大部分在出生后24 h死亡，給G2代鼠飲水中飼喂?；撬峥梢允笹3代鼠的成活率從15%提高到92%[19]。李建華[20]報(bào)道在小鼠輸卵管上皮細(xì)胞中有CSD的表達(dá)，并且在輸卵管上皮細(xì)胞也檢測(cè)到了?；撬醄21]，說(shuō)明輸卵管上皮細(xì)胞可以通過(guò)CSD途徑合成并分泌?；撬岬捷斅压芤褐?，從而調(diào)節(jié)早期胚胎的發(fā)育。KIM等[12]也報(bào)道，在ICR品系小鼠4.5、10.5、15.5、18.5 d胚胎中都能檢測(cè)到CSD mRNA的表達(dá)。另外，對(duì)小鼠卵巢進(jìn)行CSD免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從初級(jí)卵泡到三級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞都有CSD蛋白表達(dá)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)從小鼠2-細(xì)胞開(kāi)始一直到囊胚的整個(gè)發(fā)育過(guò)程都能檢測(cè)到CSD的表達(dá)，說(shuō)明胚胎自身也可以通過(guò)CSD來(lái)合成牛磺酸。結(jié)果提示著床前后胚胎中?；撬岵粌H可以由輸卵管液提供，也可以通過(guò)自身來(lái)合成一部分?；撬?。同時(shí)早期胚胎也一直有?；撬岜磉_(dá)，說(shuō)明?；撬岽_實(shí)參與了胚胎的卵裂、細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程。