段降龍，張 敏，劉思達(dá)，張金平，龍延濱，侯 峰，王朋園

(1. 陜西省人民醫(yī)院普通外科，陜西西安 712000；2. 榆林市第一醫(yī)院普通外科，陜西榆林 718000；3. 西藏民族大學(xué)，陜西咸陽 712082；4. 延安大學(xué)，陜西延安 716000；5. 西安醫(yī)學(xué)院，陜西西安 712000)

結(jié)直腸癌亦稱之為大腸癌，在我國各種惡性腫瘤發(fā)病率中居第3位。在長期的進(jìn)化演進(jìn)中，由于生存環(huán)境的差異,亞洲人種與歐美人種的遺傳背景上明顯不同，部分報道的易感性基因并不適用于亞洲人種[1]。這種差異性在人群中主要表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即在基因組DNA序列中，單個堿基的改變而導(dǎo)致的多態(tài)性。DUSP10(雙特異性蛋白磷酸酶)屬于DUSP家族的，作為一種負(fù)性調(diào)控原件，調(diào)控MAPK信號通路，與人類多種疾病密切相關(guān)。有研究表明，過表達(dá)的DUSP10可抑制直腸癌組織細(xì)胞的增殖能力[2]。PNG等[3]的研究表明，小鼠在敲除DUSP10基因后，加速了腸上皮細(xì)胞的增殖，從而使結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生概率明顯增高。DUAN等[4]研究報道，攜帶“G”等位基因者結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險降低。ZHANG等[5]發(fā)現(xiàn)rs908858位點(diǎn)增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。SMAD7基因作為抑制因子,可以負(fù)調(diào)節(jié)TGF-β信號通路，該通路中任何組分的失活都會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變。相關(guān)研究表明，G-C的單核苷酸多態(tài)性，存在于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)的一個基因片段，長度大概為44 703 563 bp，而這種多態(tài)性能夠增加SMAD7蛋白的表達(dá)，因此被認(rèn)為是結(jié)直腸癌的一種易感因素[6]。JIANG等[7]的研究顯示，等位基因T可以降低結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險。本研究將重點(diǎn)討論DUSP10和SMAD7基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的診治開拓一些新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1研究對象及一般資料收集研究對象為2013-2015年間，由陜西省人民醫(yī)院普外科和體檢中心納入符合研究標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)直腸癌患者(結(jié)直腸癌組)及正常人群作為體健對照組(對照組)。共采集了臨床確診結(jié)直腸癌患者276例及體健對照者385例，共661例外周血液樣本。病例組和對照組無年齡、性別的限制；采用統(tǒng)一的流行病學(xué)調(diào)查問卷，收集結(jié)直腸癌組和體健對照組的一般臨床資料，包含性別、年齡、飲酒、吸煙、惡性腫瘤家族史等。吸煙者定義為吸煙累計(jì)多于100支者；飲酒史定義為至少飲酒1次/周、累計(jì)時間超過1年者；腫瘤家族史為一級親屬和/或二級親屬患有癌癥者。

1.2樣本采集

1.2.1 血液樣本、DNA提取 室溫解凍血液后轉(zhuǎn)入到離心管(50 mL)中，如果血液凝固，則先用清潔的勻漿機(jī)攪拌均勻，依照DNA純化試劑盒說明提取DNA。將提取到的DNA溶液轉(zhuǎn)移到離心管(1.5 mL)中，于-20 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 將定制的引物依照規(guī)劃，混合、溶解及稀釋每個反應(yīng)內(nèi)位點(diǎn),抽取部分樣本和陽性、陰性質(zhì)控進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而對引物質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。具體按以下步驟進(jìn)行：①進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)；②進(jìn)行SAP純化反應(yīng)；③進(jìn)行單堿基延伸；④進(jìn)行樹脂純化；⑤上機(jī)進(jìn)行點(diǎn)樣；⑥進(jìn)行質(zhì)譜分析；⑦初步分析分型結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在數(shù)據(jù)分析時應(yīng)用了哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)(HWE)，若P<0.05，則說明滿足HWE平衡。在研究基因單個SNP位點(diǎn)時，使用了單位點(diǎn)分析方法，本研究中P值使用雙尾概率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且應(yīng)用了連鎖不平衡(LD)分析，參照Gabriel等的方法構(gòu)建單體型blocks，還有單體型(haplotype)分析，SHEsis軟件用于基因上位點(diǎn)之間的連鎖程度的分析，以及結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險與單體型之間的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié) 果

2.1研究對象臨床資料的比較本研究包括276例結(jié)直腸癌病例和385例健康者，一般資料見表1。Pearson’sχ2分析表明性別因素在對照組和病例組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，女性少于男性，可能因?yàn)榕员┞队谖ｋU因素的概率少于男性，又可能與男女之間的激素水平差異相關(guān)。Welch’sTtest分析表明，在對照組與病例組之間，年齡的均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，年齡偏大的患者較多，可能是由于老年人機(jī)體功能下降、發(fā)病后不重視、體檢頻率較低等原因[8]。結(jié)直腸癌組的組織分型[n(%)]：結(jié)腸型154(55.8)，直腸型106(38.4)，其他16(5.8)。

表1結(jié)直腸癌組和體健對照組基本信息的比較

Tab.1 Basic information of colorectal cancer group and control group

臨床特征結(jié)直腸癌(n=276)體健對照組(n=385)P性別[n(%)]0.007 男性171(62.0)197(51.2) 女性105(38.0)188(48.8)年齡 (x±s,歲)58.20±11.6250.67±8.430.000 <50歲(n)58191 ≥50歲(n)218194

2.2SNP分型及數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2.2.1 卡方分析結(jié)果 表2顯示了12個SNP 的基本信息。對照組12個位點(diǎn)均與哈迪-溫伯格平衡定律(P-HWE>0.05)相符；在等位基因模型下，分析獲得降低患結(jié)直腸癌風(fēng)險的位點(diǎn)有DUSP10rs908858(OR=0.697，95%CI，0.559～0.871，P=0.001)、SMAD7rs12956924 (OR=0.714，95%CI，0.553～0.923，P=0.010)；分析獲得增加患結(jié)直腸癌風(fēng)險的位點(diǎn)有SMAD7rs11874392 (OR=1.389，95%CI，1.114～1.732，P=0.003)。

表2候選基因位點(diǎn)的基本信息

Tab.2 Basic information of candidate SNPs in this study

SNP ID基因等位基因(Aa/B)MAF結(jié)直腸癌組 對照組 HWE PORs 95% CI等位基因Prs908858DUSP10G/A0.4170.5070.3050.6970.559～0.8710.001?rs12041033DUSP10G/C0.0720.0710.4191.0280.670～1.5760.901rs17010629DUSP10C/T0.2790.2940.8060.9320.731～1.1890.573rs12724393DUSP10G/C0.1240.1440.3000.8410.607～1.1650.298rs12036163DUSP10G/A0.0490.0630.6510.7690.474～1.2490.288rs11118838DUSP10C/A0.2610.2981.0000.8310.649～1.0640.142rs12044821DUSP10T/C0.0500.0640.6600.7640.471～1.2390.274rs6604668DUSP10C/T0.3850.4050.9150.9210.733～1.1580.482rs6689705DUSP10T/A0.2120.2430.2650.8400.645～1.0940.195rs12956924SMAD7A/G0.2340.2990.0840.7140.553～0.9230.010?rs11874392SMAD7A/T0.4870.4060.5971.3891.114～1.7320.003?rs1873190SMAD7T/C0.4440.4411.0001.0160.813～1.2700.890

Aa/B：對照組中的最小等位基因/參考等位基因；*P<0.05。

2.2.2 邏輯回歸分析結(jié)果 以最常見的對照組純合基因型作為參考(OR=1)，OR值和95%CI通過邏輯回歸模型計(jì)算獲得，經(jīng)性別和年齡修正后發(fā)現(xiàn)，在最佳模型-加性模型下，DUSP10rs908858能使結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險減低(OR=0.70，95%CI，0.55～0.90，P=0.0047，表3)。

SMAD7rs11874392在最佳模型-加性模型下能增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(OR=1.33，95%CI，1.05～1.68，P=0.017，表4)。

表3rs908858位點(diǎn)與結(jié)直腸癌風(fēng)險的相關(guān)性

Tab.3 Relationship between rs908858 and the risk of CRC

Model基因型對照組結(jié)直腸癌組OR (95% CI)PAICBICCodominantA/A87911A/G2011350.69(0.46～1.02)G/G92460.50(0.30～0.82)0.0180797.8820.2DominantA/A87911A/G-G/G2931810.63(0.43～0.91)0.0140797.8815.7RecessiveA/A-A/G2882261G/G92460.64(0.42～0.97)0.0350799.4817.3OverdominantA/A-G/G1791371A/G2011350.92(0.66～1.29)0.6300803.6821.5Log-additive---0.70(0.55～0.90)0.0047?795.9813.8

ORs(95%CI)代表風(fēng)險比和95%的可信區(qū)間；*P<0.05。

2.2.3 連鎖不平衡與單體型的構(gòu)建DUSP10基因上的9個SNP位點(diǎn)分別構(gòu)成了2個單體域(Block)，而單體域的構(gòu)建是根據(jù)其連鎖不平衡的系數(shù)(圖1)。Block1中包括rs12041033、rs17010629、rs12724393、rs12036163和rs11118838；Block2中包括rs12044821、rs6604668和rs6689705。在校正了年齡和性別后，邏輯回歸分析顯示DUSP10基因中的單體型“GTCAA”增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險程度高于野生型單體型(adjustedOR=10.52，95%CI：2.41～45.93，P=0.0018，表5)。

3 討 論

對結(jié)直腸癌的易感基因的研究有助于對高危人群的確定，更加及時了解結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險，進(jìn)而有指向性地改進(jìn)自己的生活方式及改變生活環(huán)境，達(dá)到避免疾病發(fā)生或推遲疾病發(fā)生的目的。

表4rs11874392位點(diǎn)與結(jié)直腸癌風(fēng)險的相關(guān)性

Tab.4 Relationship between rs11874392 and the risk of CRC

Model基因型對照組結(jié)直腸癌組OR (95% CI)PAICBICCodominantT/T138771T/A1801291.30(0.89～1.91)A/A66701.77(1.11～2.85)0.057809.7832.1DominantT/T138771T/A-A/A2461991.43(1.00～2.05)0.051809.6827.6RecessiveT/T-T/A3182061A/A66701.51(1.00～2.28)0.048809.5827.5OverdominantT/T-A/A2041471T/A1801291.04(0.74～1.45)0.820813.3831.3Log-additive---1.33(1.05～1.68)0.017?807.7825.7

ORs (95%CI) ：風(fēng)險比和95%的可信區(qū)間；*P<0.05。

表5DUSP10基因的單倍型與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

Tab.5DUSP10 haplotype and its association with the risk of CRC

rs12041033rs17010629rs12724393rs12036163rs11118838OR (95% CI)PCTCAA1-CCCAC1.01(0.72～1.43)0.93CCGAC0.77(0.52～1.13)0.18GTCGA0.74(0.45～1.23)0.25GTCAA10.52(2.41～45.93)0.0018?

ORs(95%CI)：風(fēng)險比和95%的可信區(qū)間；*P<0.05。

圖1DUSP10基因上的9個SNP位點(diǎn)連鎖不平衡圖

Fig.1 Linkage disequilibrium map for SNPs in theDUSP10 gene

本研究顯示，結(jié)直腸癌患者的性別和年齡的分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。女性患者少于男性患者，可能因?yàn)榕员┞队谖ｋU因素的概率少于男性，也可能與男女體內(nèi)激素水平的不同有關(guān)。老年患者多于年輕患者，可能是由于老年人機(jī)體功能下降、發(fā)病后不重視、體檢頻率較低等原因，這與相關(guān)方面的研究一致[8]。本研究對12個SNP位點(diǎn)成功地進(jìn)行了分型，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，DUSP10rs908858(OR=0.70，95%CI，0.55～0.90，P=0.004 7)、SMAD7rs12956924和rs11874392(OR=1.33，95%CI，1.05～1.68，P=0.017)，與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)。DUSP10(雙特異性蛋白磷酸酶)屬于DUSP家族。DUSP家族滅活靶標(biāo)激酶活性的時候，是通過去磷酸化磷酸絲氨酸/蘇氨酸和磷酸酪氨酸殘基的方式，作為一種負(fù)性調(diào)控原件，調(diào)控MAPK信號通路，與人類多種疾病密切相關(guān)。有研究表明，過表達(dá)的DUSP10可抑制直腸癌組織細(xì)胞的增殖能力[2]。PNG等[3]的研究表明，小鼠在敲除DUSP10基因后，因加速了腸上皮細(xì)胞的增殖，從而使得結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生概率明顯增高。本研究發(fā)現(xiàn)，位于DUSP10基因的等位基因rs908858“G”可降低結(jié)直腸癌的發(fā)病危險度，而DUSP10基因中的單體型“GTCAA”增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險。DUAN等[4]在其研究中報告攜帶“G”等位基因者結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險降低，這與本研究結(jié)果很相近。相反，ZHANG等[5]發(fā)現(xiàn)rs908858位點(diǎn)增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。關(guān)于該位點(diǎn)研究結(jié)果的不同，可能是樣本量不足引起的，亦或是由于多種遺傳的背景導(dǎo)致的。SMAD7基因?yàn)橐环N抑制因子,能夠?qū)GF-β信號通路進(jìn)行抑制，該通路中任何組分的失活都會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變。有研究表明，G-C的單核苷酸多態(tài)性，存在于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)的一個基因片段，它的長度大概為44 703 563 bp，而這種多態(tài)性，能夠增加SMAD7蛋白的表達(dá)，故而被看作為結(jié)直腸癌的一種易感因素[6]。rs11874392位于SMAD7基因的一個內(nèi)含子中，本研究發(fā)現(xiàn)，其突變型(小)等位基因A與直腸癌的發(fā)病具有相關(guān)性，根據(jù)JIANG等[7]的研究結(jié)果，野生型等位基因T為一種保護(hù)因素，本研究結(jié)果與其一致。JIANG等[7]的研究中顯示，等位基因T可以降低結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險。我們得到的數(shù)據(jù)中，T基因頻率為59.4%，這是一種野生型等位基因；JIANG等的結(jié)果顯示T為一種小等位基因，頻率為49%，我們得到的基因頻率比其高出10.4%。本研究還分析了5種遺傳模型，結(jié)果表明，rs11874392在加性模型下可使結(jié)直腸癌患病危險度升高。

本研究發(fā)現(xiàn)DUSP10、SMAD7基因與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險有很大的關(guān)聯(lián)，而且相對于野生型單體型，“GTCAA”明顯增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險。但是，DUSP10與SMAD7基因之間是否有相互影響而使結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險有所改變，本研究還尚未涉及，因而后續(xù)將繼續(xù)擴(kuò)大樣本，進(jìn)一步探究DUSP10與SMAD7基因之間的關(guān)系及對結(jié)直腸癌的影響。