崔凌霄，楊成德，田有輝，張收霞，張 莉，薛 莉，任寶倉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅 武威 733000)

玉米(Zeamays)是全球主要的糧食作物之一，也是世界上產(chǎn)量較高的糧食作物之一[1]，同時，玉米具有投入少、產(chǎn)出高的特點，光合產(chǎn)物總量有50%～60%貯存于秸稈當(dāng)中，是理想的飼料和工業(yè)原料[2-3]。隨著我國農(nóng)業(yè)向種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)的三元結(jié)構(gòu)發(fā)展，特別是畜牧業(yè)的快速發(fā)展，玉米的重要地位將更加突出，并且飼用玉米的比例將不斷上升。20世紀(jì)90年代后，全世界飼用玉米占玉米總產(chǎn)量的70%以上[4]，因其蛋白含量高、產(chǎn)量高和適口性好等特點，已成為畜牧業(yè)的支柱作物。飼用玉米的種植緩解了天然草地的壓力，解決了長期以來的草畜矛盾，未來會是我國重要的栽培飼草之一。由于農(nóng)業(yè)發(fā)展對飼用玉米的強烈需求、大面積推廣種植和重茬等原因，導(dǎo)致普通糧用玉米上發(fā)生的土傳病害在飼用玉米上也嚴(yán)重發(fā)生，尤其是莖腐病(又稱玉米莖基腐病)。自20世紀(jì)初，玉米莖腐病初次報道以來，該病已成為世界上玉米種植區(qū)普遍發(fā)生的一種重要土傳病害[5]，美國、加拿大、印度和南斯拉夫等國家發(fā)生較重[6]。70年代中期至今，該病先后在我國廣西、浙江、湖南、陜西、河北、山東、遼寧等省區(qū)發(fā)生，一般年份發(fā)病率10%～20%，遇到多雨年份，發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)80%以上，減產(chǎn)25%，嚴(yán)重者甚至絕收[7-10]，該病在飼用玉米上的嚴(yán)重發(fā)生制約了我國畜牧業(yè)的發(fā)展。目前該病害仍呈擴(kuò)展趨勢，危害逐年加劇，并已成為玉米生產(chǎn)上亟待研究解決的重要問題。玉米作為甘肅省主要的糧飼兼用作物被大面積種植，據(jù)調(diào)查顯示，玉米莖腐病已在張掖、武威及蘭州等地發(fā)生，致使玉米葉鞘及莖稈腐爛、枯死，植株倒伏，嚴(yán)重時可導(dǎo)致整株死亡，對玉米的產(chǎn)量和飼用品質(zhì)均有嚴(yán)重影響。玉米莖腐病由多種病原菌單獨或復(fù)合侵染引起，主要病原為腐霉菌和鐮刀菌。在多雨地區(qū)，玉米莖腐病一般以腐霉菌型莖基腐為主，而在干旱地區(qū)以鐮刀菌型莖基腐為主[11]；其中鐮孢屬主要以禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、層出鐮孢菌(F.proliferatum)和輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)為主[12]，以藤倉鐮孢菌(F.fujikuroi)引起的玉米莖腐病未見系統(tǒng)報道。本研究首次分離鑒定得到了引起玉米莖腐病的病原——藤倉鐮孢霉菌，并對其進(jìn)行了病害癥狀描述和生物學(xué)特性測定，以期為該病害的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采自甘肅省張掖市臨澤縣玉米田。供試培養(yǎng)基為PDA通用培養(yǎng)基和孟加拉紅選擇培養(yǎng)基[13]。

1.2 方法

1.2.1田間癥狀 對大田自然條件下玉米莖腐病的癥狀進(jìn)行觀察和描述。

1.2.2病原菌的分離與致病性測定 采用常規(guī)組織分離方法在PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)。選取癥狀典型的新鮮標(biāo)本，從病斑、病健交界處用刀片切取約0.5 cm2的病組織塊，在70%乙醇內(nèi)消毒約10 s，然后在0.1%的升汞水溶液中消毒2 min，再用無菌水清洗5次后置于平板上培養(yǎng)，對分離物進(jìn)行單孢分離純化和保存?zhèn)溆肹9]。

玉米幼苗3-4葉齡用針刺致傷幼苗莖稈，將分離物制成孢子(菌絲)懸浮液于致傷處噴霧接種，以噴清水為對照，在相對濕度100%條件下保濕48 h后，置于室內(nèi)常規(guī)條件下連續(xù)觀察玉米植株發(fā)病情況，按照柯赫氏法則[9]確定病原菌。

1.2.3病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株接于PSA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)待產(chǎn)孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)特征；在40倍鏡下分別測定大、小分生孢子，厚垣孢子大小(50個)，并進(jìn)行顯微拍照。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參照文獻(xiàn)[14]和[15]進(jìn)行鑒定。

1.2.4ITS基因序列分析鑒定 DNA的提取、PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.2.5生物學(xué)特性測定 將菌株分別置于不同溫度、pH、碳源、氮源和濕度條件下培養(yǎng)，并測定各條件對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響，具體方法參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；采用SPSS 19.0軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，分別對不同條件下菌絲生長結(jié)果、不同條件下孢子萌發(fā)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

在田間，玉米莖腐病主要發(fā)生于6-8月，即一般為灌漿期和乳熟期達(dá)發(fā)病高峰，受害玉米植株莖部葉鞘表皮呈圓形、近圓形或不規(guī)則形病斑，邊緣深褐色或黑褐色，中央灰白色，后期病斑部位漸溢縮變硬，病部莖稈空松，內(nèi)部腐爛，發(fā)病嚴(yán)重時病斑繞莖桿一圈；濕度大時可見白色或粉色霉層，濕度小時失水枯縮，且葉片變黃，萎蔫，致植株早衰(圖1)。

圖1 玉米莖腐病癥狀Fig.1 Symptoms of maize stalk rot

2.2 病原菌的分離純化及致病性測定

從受害5株玉米植株病部通過組織分離獲得3株真菌分離物，編號分別為Y1、Y2和Y3，單孢分離純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

將分離物制成孢子懸浮液，用致傷噴霧法接種于室內(nèi)盆栽的玉米植株上(以清水噴霧為對照)，保持100%相對濕度，48 h后置于室內(nèi)常溫條件下連續(xù)觀察，2周后接種Y1的玉米植株葉鞘及莖稈部位出現(xiàn)灰褐色或褐色不規(guī)則病斑，葉片發(fā)黃，與田間典型癥狀一致(圖2)，在發(fā)病部位再次分離得到接種菌；對照和Y2、Y3處理沒有形成任何癥狀。根據(jù)柯赫氏法則，確定Y1為引起玉米莖腐病的病原菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征 菌株Y1在PDA培養(yǎng)基上菌落致密，灰白色(圖3)；菌絲有隔，有分枝。大型分生孢子呈鐮刀形，多細(xì)胞無色，3～5隔，大小為4.54～11.74 μm×1.96～4.27 μm；小型分生孢子數(shù)量多，卵圓形或橢圓形，單胞無色，大小為1.25～5.50 μm×1.25～3.75 μm。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，參考文獻(xiàn)[11]、[12]初步鑒定該病原菌為鐮孢霉屬真菌(圖3)。

2.3.2病原菌ITS基因序列分析 提取病原菌Y1的基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序，該序列全長553 bp，所測序列與GenBank中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast相似性分析，經(jīng)同源性比較，該病原菌與鐮刀菌屬藤倉鐮孢霉菌的同源性達(dá)99%(圖4)。通過Clustal X1.83程序多重序列比對，用Mega7.0軟件采用鄰接法(neighbor-joining)建立ITS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，病原菌ITS基因序列與藤倉鐮孢霉菌(KJ000440.1)在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，結(jié)合形態(tài)特征，鑒定病原菌Y1為藤倉鐮孢霉菌。

2.4 生物學(xué)特性測定

2.4.1溫度對菌絲生長的影響 病原菌Y1在5～40℃內(nèi)均可生長，5～25 ℃時生長速度快，25 ℃時達(dá)最大，且菌落平均直徑達(dá)6.40 cm，25和30 ℃間差異不顯著(P>0.05)，高于30 ℃后生長速度較25和30 ℃顯著降低(P<0.05)，低于5 ℃和高于40 ℃菌落不生長。綜上，該病原菌的最適生長溫度為25～30 ℃(圖5)。

圖2 致病性測定Fig. 2 Pathogenicity test

圖3 菌株Y1形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of strain Y1

圖4 菌株Y1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strainY1

2.4.2溫度對孢子萌發(fā)的影響 病原菌Y1的孢子在5～40 ℃范圍內(nèi)均可萌發(fā)，5～25 ℃時孢子萌發(fā)率顯著增長，25 ℃時孢子萌發(fā)率達(dá)到70%以上，顯著高于其他溫度處理(P<0.05)(圖6)。25～40 ℃孢子萌發(fā)率較20和25 ℃顯著降低(P<0.05)。因此，該病原菌的孢子最適萌發(fā)溫度為25 ℃。

2.4.3pH對菌絲生長的影響 病原菌Y1在pH為4～10內(nèi)均生長，在pH為8時菌落直徑顯著大于其他pH(P<0.05)，且菌落平均直徑達(dá)6.65cm(圖7)。因此，該菌在中性偏堿的環(huán)境下生長良好，最適生長pH為8。

圖5 溫度對菌株Y1菌絲生長的影響Fig. 5 Effect of temperature on hyphae growth of strain Y1

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters show significant differences at the 0.05 level; similarly for the following figures.

圖6 溫度對菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 6 Effect of temperature on spore germination of strain Y1

圖7 pH 值對菌株Y1菌絲生長的影響Fig. 7 Effect of pH on hyphae growth of strain Y1

2.4.4碳源對菌絲及孢子萌發(fā)的影響 從培養(yǎng)特性看，供試10種碳源及對照所培養(yǎng)病原菌Y1菌落均為淡粉色，在D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖培養(yǎng)基上菌絲稠密，菌落生長速度快，是該菌菌絲生長的良好碳源，且顯著高于其他供試碳源(P<0.05)；但在L-山梨糖、蔗糖培養(yǎng)基中菌絲生長速度較差，第4 天時菌落直徑分別僅為4.46和5.42 cm，顯著低于對照(P<0.05)，但均可以生長，表明該病菌可以利用單糖、雙糖和多糖等多種碳源(圖8)。

在9種碳源中，病原菌Y1的孢子均能萌發(fā)，其中L-山梨糖萌發(fā)率最高，顯著高于其他碳源(P<0.05)，其次為阿拉伯糖和D-木糖，在葡萄糖中的萌發(fā)率最低(圖9)。

2.4.5氮源對菌落及孢子萌發(fā)的影響 從培養(yǎng)特性看，病原菌Y1在胰蛋白胨培養(yǎng)基上菌絲淡紅褐色，菌絲層較緊密呈絮狀；碳酸銨培養(yǎng)基上菌絲灰色或土褐色，菌絲呈索狀；其他氮源培養(yǎng)基菌絲稀疏，無色或皿底略顯淡褐色；在以氯化銨和硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌落生長速度顯著高于其他氮源(P<0.5)，且4 d后菌落直徑達(dá)7.53和7.46 cm，表明氯化銨和硫酸銨有利于菌絲生長；其他(除干酪素)氮源培養(yǎng)基菌落直徑均小于對照，表明該菌株對其利用能力差，尤其以碳酸銨效果最差(圖10)。

圖8 碳源對菌株Y1菌落生長的影響Fig. 8 Effect of C-source on hyphae growth of strain Y1

圖9 碳源對菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 9 Effect of C-source on spore germination of strain Y1

病原菌Y1的孢子能在不同的氮源中萌發(fā)，但在干酪素中的萌發(fā)率較高，顯著高于其他氮源(P<0.05)，在牛肉膏和蛋白胨中的萌發(fā)效果較差(圖11)。

2.4.6濕度對孢子萌發(fā)的影響 病原菌Y1的孢子只有在相對濕度大于90%時才能萌發(fā)，在相對濕度達(dá)到100%時萌發(fā)效率最好，顯著高于其他濕度(P<0.05)(圖12)。

圖10 氮源對菌株Y1菌絲生長的影響Fig. 10 Effect of N-source on hyphae growth of strain Y1

圖11 氮源對菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 11 Effect of N-source on spore germination of strain Y1

圖12 濕度對菌株Y1孢子萌發(fā)的影響Fig. 12 Effect of humidity on spore germination of strain Y1

3 討論與結(jié)論

玉米莖腐病是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種土傳病害，其病原存在多樣性，各地區(qū)報道的病原種類也各不相同。據(jù)報道，該病主要由腐霉菌和鐮刀菌單獨或復(fù)合侵染造成玉米根系和莖基腐爛[17]。美國玉米莖腐病主要致病菌以亞月牙鐮刀菌(F.subglutinas)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和玉米干腐菌(Diplodiamaydis)為主[18]。俄羅斯、烏克蘭主要以禾谷鐮刀菌為主。西歐國家多以玉米穗粒干腐菌(F.zeae)和串珠鐮刀菌(F.moniliforme)為主。禾生腐霉菌(Pythiumgraminicola)和瓜果腐霉(P.aphanidermatum)是日本玉米莖腐病的主要致病菌。據(jù)晉齊鳴等[19-21]、吳全安等[22]的研究與報道，在大田自然條件下，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)、禾谷鐮刀菌、禾生腐霉菌和鏈狀腐霉菌(P.catemulatum)對玉米植株均有致病性，引起玉米莖腐病，且致病性強弱各有不同，田間癥狀多呈青枯、黃化和青黃枯。但本研究所得藤倉鐮孢霉菌病原菌所引起玉米的癥狀與上述幾種病原菌略有不同，與玉米鞘腐病(F.proliferatum)主要危害玉米葉鞘中下部位，形成不規(guī)則褐色糜爛狀病斑[23]和糧用玉米莖腐病導(dǎo)致葉鞘和莖稈髓部出現(xiàn)腐爛, 葉鞘內(nèi)側(cè)和緊靠莖稈皮層呈鐵銹色腐爛等癥狀[24]也存在差異。藤倉鐮孢霉菌主要引起玉米莖稈變枯、變褐及腐爛，該癥狀可能由于寄主品種不同，或者病原菌菌株差異等引起。本研究對田間采集的、具有典型玉米莖腐病癥狀的玉米標(biāo)本，進(jìn)行了分離培養(yǎng)和致病性測定，得到致病菌Y1，結(jié)合其形態(tài)特征和ITS基因序列分析結(jié)果，將其鑒定為鐮孢霉屬藤倉鐮孢霉菌，即藤倉鐮孢霉菌可引起甘肅玉米發(fā)生莖腐病，該菌引起玉米莖腐病為首次報道。

甘肅玉米莖腐病多集中發(fā)生于6-8月，平均氣溫為24.2 ℃[25]，本研究中病原菌菌絲生長最適溫度為25～30 ℃，即玉米莖腐病發(fā)病的環(huán)境溫度與本研究溫度對該菌菌絲及孢子萌發(fā)的影響趨勢相一致。該病菌在pH為4～10均能生長，最適pH為8，說明該菌較適宜在偏堿土壤中生長，最適pH與張志博等[26]報道的該菌最適生長pH相吻合。因此，可選擇略偏酸土壤種植，施肥改善土壤酸堿性，減少病害發(fā)生。由該病原菌最適生長的溫度范圍和pH得知，該菌是一種具有較強適應(yīng)性、耐熱性的強抗逆性致病菌。

本研究結(jié)果表明，不同碳、氮源營養(yǎng)條件對藤倉鐮刀菌菌落生長及孢子萌發(fā)也有不同的影響，且此病菌能利用多種碳源，在本研究所用的9種碳源中，病菌對D-半乳糖的利用效果最好，菌絲生長最快，對L-山梨糖利用較差，菌絲生長緩慢。該結(jié)果與張志博等[26]報道玉米莖腐病菌的最適碳源為葡萄糖存在差異，可能是由于病原菌種不同所致。該病菌孢子萌發(fā)的最適碳源為L-山梨糖，與病原菌菌絲生長截然相反，即適合菌絲生長的物質(zhì)條件并不一定適合其孢子萌發(fā)。在多數(shù)無機氮、有機氮條件下生長不良，尤以碳酸銨抑制作用顯著(P<0.05)。因此，在生產(chǎn)中可以適量使用碳酸銨等肥料發(fā)揮其對菌絲生長的抑制作用，有利于對病害的控制。該菌的孢子在相對濕度為100%時萌發(fā)效果最好，低于100%萌發(fā)率顯著降低，因此可通過控制田間的相對濕度，來減少玉米莖腐病害的發(fā)生。