李具鵬,傅茂潤,楊曉穎

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東濟南 250353)

葡萄(VitisviniferaL.)果梗的品質(zhì)對消費者偏好和市場價格有顯著的影響。果梗褐變降低了采后葡萄的品質(zhì),這是影響鮮食葡萄品質(zhì)的非常重要的問題[1]。Crisosto等[2]研究表明,褐變的主要原因與失水有關(guān)。Lichter等[3]研究表明,水分損失盡管非常重要,但并不是褐變的唯一因素。許文平[4]研究發(fā)現(xiàn),1-MCP抑制了躍變型果實果肉組織多酚氧化酶(PPO)活性的增加和減緩總酚含量的下降,減輕了果肉組織的褐變程度。盛蕾[5]也發(fā)現(xiàn),在南國梨果皮褐變期間,PPO活性顯著升高,總酚含量顯著下降,并且與膜脂代謝的相關(guān)基因PuPLD和PuLOX的表達水平顯著上調(diào)。Li等[6]研究表明,1-MCP處理可延遲葡萄梗的褐變。但對果梗褐變的分子機理研究鮮有報道,本文旨在從葉綠素降解途徑討論1-MCP延遲葡萄果梗褐變的分子機理。

1-MCP是一種乙烯效應(yīng)抑制劑,廣泛用于水果保鮮。Hershkovitz等[7]研究表明,低濃度1-MCP處理能降低鱷梨葉綠素的降解,抑制葉綠素酶的活性,降低與果皮變色相關(guān)的多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)的活性。Luo等[8]研究發(fā)現(xiàn),1-MCP處理有利于保持梅果實可溶性固形物與可滴定酸度的含量,并且抑制了葉綠素酶活性,延緩了葉綠素的分解,延長了梅的貨架期。吳小華等[10]研究發(fā)現(xiàn),1-MCP處理能顯著抑制黃冠梨常溫貯藏期間果心褐變的發(fā)生,但其分子機制尚未闡述。

葉綠素的降解途徑已在葉片的衰老過程得到闡述,是一個多補酶促反應(yīng)[11]。首先,葉綠素b在葉綠素b還原酶(NYC1)、NOL(NYC1-like)及7-羥甲基葉綠素還原酶(HCAR)作用下轉(zhuǎn)化為葉綠素a;其次,葉綠素a脫去Mg2+,在脫鎂葉綠素水解酶(PPH)作用下生成脫鎂葉綠酸a;然后,脫鎂葉綠酸a通過脫鎂葉綠酸氧化酶(PAO)進一步分解,通過紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶(RCCR)生成初級熒光葉綠素代謝產(chǎn)物(pFCC),期間有保綠基因(SGR1)參與反應(yīng);最后pFCC轉(zhuǎn)化為線性四吡咯產(chǎn)品存儲在衰老細(xì)胞的液泡內(nèi)。本實驗選取上述參與葉綠素降解途徑的基因進行相對表達量的分析,以探究1-MCP對葡萄梗具有保綠作用的分子機制。

巨峰葡萄是鮮食葡萄中重要的商業(yè)品種,采后貯藏中其果梗很容易發(fā)生褐變[9]。本研究的目的是探討1-MCP和乙烯對葡萄果梗品質(zhì)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)與葉綠素降解途徑相關(guān)基因的影響。測定了呼吸速率、可溶性糖含量、水分含量、褐變指數(shù)、色差和葉綠素含量,以及通過透射電鏡觀察了葉綠體超微結(jié)構(gòu)。同時,利用定量RT-PCR分析了葉綠素分解的分子機制及其對褐變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“巨峰”葡萄(V.viniferacv. Kyoho) 采摘于濟南市長清區(qū)葡萄園;酚酞指示劑、氫氧化鈉、草酸、2,6-二氯靛酚、丙酮、3,5-二硝基水楊酸等試劑,次氯酸鈉(NaClO)溶液(有效氯含量≥10%)等 均為分析純(AR),濟南力戈科技有限公司。

FLY-YS-828L型恒溫保鮮柜 北京福意電器有限公司;YP-20002型電子天平 金諾天平儀器有限公司;WSC-S型色差計 上海海精科物理光學(xué)儀器廠;TGL16型臺式低溫冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司;V1100D型可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;熒光定量PCR儀(FQD-96A) 杭州博日科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 挑選成熟度一致,無損傷、無腐爛的果實,用1%的次氯酸鈉消毒2 min晾干后備用。預(yù)試驗結(jié)果表明1-MCP處理有利于保持葡萄果梗的品質(zhì),延緩褐變程度。本實驗繼續(xù)采用預(yù)實驗的處理條件進行三個處理:1.0 μL/L 1-MCP處理,100 μL/L乙烯處理,空白對照。將各處理葡萄分別置于0.1立方米的密封塑料容器內(nèi)熏蒸,處理溫度(10±2) ℃,熏蒸時間為24 h,每組處理放置6串葡萄。將各處理好的葡萄分別放入塑料筐內(nèi),再放進PE保鮮袋(厚0.03 mm)后扎緊袋口,于保鮮柜(10±2) ℃中貯藏,每2 d觀察測定相關(guān)指標(biāo),貯藏時間為8 d。每個處理重復(fù)3次。

1.2.2 呼吸強度與可溶性糖含量測定 呼吸強度參照楊振生[12]的靜置法。結(jié)果以CO2mL·kg-1·h-1表示?？扇苄蕴呛康臏y定使用蒽銅法測定[13]。每個處理測定三次重復(fù)。

1.2.3 果梗褐變指數(shù)的測定 參照Champa等[14]方法稍作改動,將葡萄果梗的褐變面積分為4級,沒有干褐的為1級,整個果梗都保持綠色;輕微干褐2級,干褐面積0～1/4,只有果梗的分支有輕微的褐變;中等干褐為3級,干褐面積1/4～3/4,果梗與次級分支有中等程度的褐變;干褐3/4以上的為4級,整個果梗與次級分支發(fā)生嚴(yán)重的褐變。

果梗褐變指數(shù)(%)

1.2.4 果梗組織含水率的測定 稱5～10 g樣品在60～70 ℃干燥2～3 h,然后在100～105 ℃烘箱中烘至恒重。

1.2.5 色差、葉綠素含量的測定 使用WSC-S型測色色差計進行色差測定。葉綠素含量的測定參照李合生[15]法。三次重復(fù)。

1.2.6 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡參照徐萍[16]的方法。將貯藏8 d時不同處理的葡萄果梗切成片(0.1 cm×0.1 cm×0.3 cm),立即放入含有3%戊二醛固定液(pH7.2)的瓶中,置于4 ℃冰箱固定24 h。樣品經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后,轉(zhuǎn)入1%鋨酸中,4 ℃固定12 h。樣品經(jīng)沖洗、乙醇逐級脫水后,轉(zhuǎn)入Epon812環(huán)氧樹脂內(nèi)浸透包埋。用LKB-V型超薄切片機切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對切片雙重染色后,用日產(chǎn)JEOL-1200EX型透射電鏡觀察、拍照。

1.2.7 葉綠素降解相關(guān)基因的表達分析 總RNA提取使用TaKaRa MiniBEST Plant試劑盒。PrimescriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈(購自TaKaRa公司)。采用primer premier 6.0軟件進行引物設(shè)計,以Vlactin-7為內(nèi)參基因。引物序列(表1)由生工生物工程(上海)公司合成。使用FQD-96A熒光定量PCR儀和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行基因相對表達水平分析。反應(yīng)程序為95 ℃ 10 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán)。qRT-PCR的數(shù)據(jù)分析采用 2-ΔΔCT方法,每個處理樣品設(shè)置3次重復(fù)。

表1 qRT-PCR 所用引物Table 1 Sequences of the primers used for qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)使用SAS 9.4進行差異顯著性分析,采用Excel 2016軟件進行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗的呼吸速率和可溶性糖含量的影響

1-MCP和乙烯處理對葡萄梗呼吸速率的影響如圖1所示。由圖1可知,在對照中,0 d后呼吸速率大幅增加,4 d達到峰值,隨后在6、8 d時急劇下降。乙烯處理增加了果梗呼吸速率,但沒有改變高峰的時間。1-MCP處理后,貯藏2～4 d,呼吸速率顯著低于對照組和乙烯處理組(p<0.05)。結(jié)果表明,1-MCP處理明顯抑制了貯藏前期葡萄梗的呼吸速率,并發(fā)現(xiàn)在貯藏過程中葡萄梗出現(xiàn)呼吸高峰,與Li等[6]報道相似。

圖1 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗呼吸速率的影響Fig.1 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on respiration rate of grape rachis

1-MCP和乙烯處理對葡萄?？扇苄蕴呛康挠绊懭鐖D2所示。由圖2可知,貯藏期間葡萄梗中可溶性糖含量呈逐漸下降的趨勢。與對照和乙烯處理相比,用1-MCP處理的果梗中可溶性糖含量在4～8 d更高;貯藏8 d后,1-MCP處理比乙烯處理的可溶性糖含量高17.0%,這與1-MCP處理的果梗中的較低的呼吸速率(圖1)相一致。

圖2 1-MCP和乙烯處理對葡萄?？扇苄蕴呛康挠绊慒ig.2 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on soluble sugar content of grape rachis

2.2 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗褐變和組織含水量的影響

1-MCP和乙烯處理對葡萄梗的保鮮效果如圖3所示。由圖3可知,與對照和乙烯處理相比,采用1-MCP處理的葡萄梗直至8 d仍保持健康的綠色,只在次生軸中出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。對照和乙烯均已達到商業(yè)不可接受的程度。由圖4可知,在采后貯藏期間,葡萄梗的褐變指數(shù)逐漸增加,并在貯藏后期達到最大。乙烯處理加劇了褐變,在貯藏8 d時,1-MCP處理與對照相比降低了16.7%。

圖3 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗的保鮮效果Fig.3 Effect of 1-MCP and ethylenet treatments on preservation of grape rachis

圖4 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗褐變指數(shù)的影響Fig.4 Effect of 1-MCP and ethylenetreatments on rachis browning of grape rachis

1-MCP和乙烯處理對葡萄梗組織含水量的影響如圖5所示。由圖5可知,隨著貯藏時間的延長,組織含水量呈下降趨勢。乙烯和對照組中組織含水量降低明顯,而1-MCP處理的果梗水分損失最小。在貯藏到8 d時,與初始含水量(0 d)相比,對照和乙烯處理的果梗分別損失了10.3%、11.67%,而1-MCP處理損失了7.03%。結(jié)果表明,1-MCP處理有利于保持葡萄梗的組織含水量。

圖5 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗組織含水量的影響Fig.5 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on tissue water content of grape rachis

2.3 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗色差與葉綠素含量的影響

1-MCP和乙烯處理對葡萄梗L*(圖A)值和a*(圖B)值的影響如圖6所示。由圖6可知,對照、乙烯和1-MCP處理的葡萄梗,其亮度(L*)和綠色度(-a*)存在差異。其中1.0 μL/L 1-MCP處理明顯(p<0.05)抑制了-a*值的上升。在8 d時,1-MCP、對照和乙烯處理的果梗的亮度(L*)分別下降約11%、16%、21%。

圖6 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗L*(A)值和a*(B)值的影響Fig.6 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on L* value(A)and a* value(B)of grape rachis

水果中顏色的變化與葉綠素含量的減少和類胡蘿卜素合成的增加相關(guān)[17]。1-MCP和乙烯處理對葡萄梗葉綠素含量的影響由圖7所示。由圖7可知,在貯藏期間,葡萄果梗中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素a+b的含量變化呈下降趨勢。在對照組中,尤其是在乙烯處理中,葉綠素含量急劇下降。在8 d時,1-MCP處理的“巨峰”葡萄梗中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量分別比對照高出18.0%、26.4%、26.5%。

圖7 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗葉綠素a(A)、葉綠素b(B)、葉綠素a+b(C)含量的影響Fig.7 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on chlorophyll a(A),chlorophyll b(B),chlorophyll a+b(C)concentrations of grape rachis

2.4 1-MCP和乙烯處理對葡萄果梗葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

綠色組織中的葉綠體呈梭形或橢圓形,具有完整的膜系統(tǒng),并且類囊體堆疊緊密且有序。1-MCP和乙烯處理對葡萄梗表皮細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響如圖8所示。由圖8可知,在8 d時,乙烯處理的葉綠體膜受到嚴(yán)重破壞,基粒分散,葉綠體基質(zhì)降解分散到細(xì)胞質(zhì)中。在對照中,葉綠體是腫脹形的,葉綠體膜明顯受損。相反,用1-MCP處理的果梗具有結(jié)構(gòu)更完整的葉綠體,其葉綠體膜完整且和基粒組織良好。由此表明,1-MCP處理延緩了“巨峰”葡萄果梗表皮組織中葉綠體的分解。

圖8 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗表皮細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on chloroplast ultrastructure of grape rachis注:cm:葉綠體膜;g:葉綠體基粒;sg:淀粉粒;p:質(zhì)體小球。

2.5 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗葉綠素降解途徑基因表達的影響

葉綠素分解途徑相關(guān)基因的表達量以對照組0 d的表達量為標(biāo)準(zhǔn)。1-MCP和乙烯處理對葡萄梗葉綠素降解相關(guān)基因表達量的影響如圖9所示。由圖9可知,對照組葡萄梗中,VlNYC1、VlHCAR、VlPPH、VlPAO和VlSGR1的表達量在儲存期間整體呈現(xiàn)增加的趨勢,VlNOL的表達量無顯著變化(p>0.05),VlRCCR顯示輕微降低,貯藏0～4 d和貯藏6～8 d之間差異顯著(p<0.05)。1-MCP處理顯著下調(diào)了VlNYC1、VlHCAR、VlPAO和VlSGR1基因的表達;除VlPPH的表達在2、8 d時受到抑制,1-MCP處理對VlNOL、VlRCCR和VlPPH的表達基本沒有影響;除貯藏8 d外,乙烯處理顯著上調(diào)了VlNYC1、VlHCAR、VlPPH、VlPAO和VlSGRl的表達(p<0.05)。結(jié)果表明,1-MCP和乙烯通過調(diào)節(jié)葉綠素分解途徑相關(guān)基因的表達來影響葉綠素的分解。

圖9 1-MCP和乙烯處理對葡萄梗葉綠素降解相關(guān)基因表達量的影響Fig.9 Effect of 1-MCP and ethylene treatments on expression of chlorophyll breakdown pathway genes of grape rachis注:不同小寫字母表示相同貯藏時間不同處理之間差異顯著(p<0.05)。

3 討論

果梗褐變是葡萄采后貯藏中出現(xiàn)的不利的特征,導(dǎo)致葡萄品質(zhì)下降,商品性降低。Crisosto等[18]研究表明,防止果梗褐變的先決條件是在相對高濕度環(huán)境下貯藏以減少水分流失。然而Li等[5]研究表明,乙烯參與了果梗的褐變過程,1-MCP顯著降低了貯藏期間葡萄果梗的呼吸速率,呼吸速率隨著貨架期的延長而降低。本研究中,與對照和乙烯相比,1.0 μL/L 1-MCP處理推遲并降低了呼吸峰值。

由果實本身釋放的內(nèi)源乙烯可能加速果皮中葉綠素的降解,如梨[19]、香蕉和蘋果[20]。本研究中,外源乙烯加速了貯藏期間果梗褐變和葉綠素的降解。果實成熟衰老過程中,葉綠體分解形成有色體[21-22]。本文通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn),乙烯加速了葉綠體的分解,而1-MCP有利于維持葡萄梗表皮細(xì)胞中葉綠體的完整性。PAO是葉綠素分解的關(guān)鍵調(diào)控因子,其表達量與葉片衰老呈正相關(guān)[23]。葉綠素b降解的第一步是轉(zhuǎn)化為葉綠素a,由NYC1、NOL和HCAR催化[24]。NOL(NYC1-like)是編碼與 NYC1 基因非常相似的蛋白,在體外試驗中均顯示出葉綠素b還原酶活性,在類囊體膜中以復(fù)合物的形式起作用[25-26]。Cheng等[27]報道,在梨果實中,1-MCP可以抑制PAO、NYC、NOL、SGR1和PPH的表達,推遲了葉綠素分解代謝途徑中的下游反應(yīng),從而延緩果皮黃化期間葉綠素的降解。本研究表明,1-MCP處理抑制了果梗的褐變以及VlNYC1、VlHCAR、VlPAO和VlSGR1的表達,延緩了“巨峰”葡萄果梗中葉綠素的降解。以上表明,乙烯和1-MCP可以在細(xì)胞和分子水平上調(diào)節(jié)果梗的褐變。

4 結(jié)論

本文研究表明,“巨峰”葡萄采后果梗褐變的部分原因是葉綠體分解和葉綠素降解。1-MCP有效延遲了葡萄果梗的褐變程度、葉綠素降解和葉綠體分解,而乙烯的作用是相反的。與乙烯和對照處理的果梗相比,1-MCP處理的葡萄果梗,其與葉綠素分解相關(guān)的VlNYC1、VlPAO、VlSGR1和VlHCAR基因的表達量顯著降低。1-MCP處理也降低了果梗的呼吸速率和水分流失。因此,1-MCP可應(yīng)用于葡萄采后貯藏保鮮,有利于保持采后葡萄果梗的品質(zhì)。