楊子微，王俊霞，車雅敏，單士軍

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科，天津 300052）

瘢痕是由各種創(chuàng)傷如燙燒傷、外科手術(shù)、嚴(yán)重外傷所致的皮膚組織形態(tài)和組織病理學(xué)改變后愈合的生理反應(yīng)，它是機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)的必然形式。瘢痕組織早期過(guò)度愈合或后期過(guò)度萎縮均會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響，如皮膚外觀改變及功能障礙等。瘢痕的形成機(jī)制尚未明確，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與創(chuàng)傷修復(fù)中成纖維細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原及一些細(xì)胞因子和信號(hào)通路有關(guān)。其中常見(jiàn)的有：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），Ⅰ型前膠原和Ⅲ型前膠原，白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等。薰衣草屬唇形科亞灌木，在我國(guó)主要分布于伊犁地區(qū)。薰衣草因其藥效廣泛，在古羅馬時(shí)期已開(kāi)始廣泛應(yīng)用，也是中國(guó)維吾爾醫(yī)藥中的重要藥材。有研究證明薰衣草油具有抑菌、提高免疫功能、降血壓、松弛平滑肌、鎮(zhèn)靜催眠、抗凝血等作用[1]。本研究旨在通過(guò)觀察薰衣草油對(duì)深Ⅱ度燙傷小鼠上背部創(chuàng)面和瘢痕的治療作用分析并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 精油配置液（薰衣草油與橄欖油以1∶4比例混合配置），多磺酸粘多糖乳膏（喜遼妥，MobilatProduktionsGmbh），8%硫化鈉，1%水合氯醛溶液，白細(xì)胞介素-10酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，一型前膠原蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，三型前膠原蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(上海寶曼生物技術(shù)有限公司)，甲醛，70%乙醇。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠32只，6～8周齡，雄雌各半，體質(zhì)量22～25 g，來(lái)源于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組小鼠在恒定的室溫[（25±1）℃]和濕度（60%）條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為4組，分別為空白組、模型組、多磺酸粘多糖組和精油組。空白組和模型組每組6只，其余兩組各10只，雄雌各半。各組分籠飼養(yǎng)，保持自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食，定期清潔消毒。

1.3.2 造模 小鼠腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，8%硫化鈉溶液進(jìn)行上背部的脫毛2 cm×4 cm。24 h后，小鼠局部外用70%乙醇消毒脫毛區(qū)，將恒溫水浴箱水溫升至95℃恒溫，將小鼠脫毛區(qū)置于蒸汽口上端10 cm處10 s后移開(kāi)，燙傷面積等于脫毛面積。建立小鼠深Ⅱ度的燙傷模型（病理切片觀察后證實(shí)）。造模后腹腔注射生理鹽水2 mL以抗休克。

1.3.3 治療方案 治療期間各組小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食。模型組50 μL生理鹽水棉簽按摩。多磺酸粘多糖組2 g喜遼妥棉簽按摩。精油組50 μL薰衣草油棉簽按摩。每日兩次，間隔12 h，連續(xù)給藥28 d。

1.3.4 觀察及指標(biāo) 觀察小鼠燙傷處面積變化，炎癥感染情況，結(jié)痂及其脫落情況，瘢痕形成后顏色、面積、硬度的變化。第7天鼠尾取血和第28天眼球取血，第7天和第28天剪下部分瘢痕組織，轉(zhuǎn)速3 400 r/min離心15 min，分離上清液，血標(biāo)本和組織液標(biāo)本均-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA試劑盒檢測(cè)TGF-β1、Ⅰ/Ⅲ型前膠原、IL-10的含量變化，按試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)量。

1.3.5 病理學(xué)檢查 剪取治療28 d的小鼠瘢痕，10%甲醛固定，縱向和橫向切取寬約3～4 mm皮膚組織標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度為4 μm，蘇木精-伊紅(HE)和染色，顯微鏡觀察病理學(xué)變化并測(cè)量表皮厚度、瘢痕厚度和毛囊情況。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[對(duì)于表皮厚度、瘢痕厚度兩指標(biāo)組間比較，組間比較采用LSD方法；毛囊指標(biāo)描述采用M（P25-P75）描述，組間比較采用Kruskall-Wallis H檢驗(yàn)]

2 結(jié)果

2.1 皮損變化及瘢痕的觀察 記錄治療后第3天，模型組傷口有膿性分泌物。多磺酸粘多糖組傷口處有少許分泌物，精油組炎癥反應(yīng)輕。造模治療后第7天，模型組皮損大部分壞死，有滲出，痂皮厚硬，創(chuàng)緣紅腫明顯。多磺酸粘多糖組大部分痂皮覆蓋，可見(jiàn)少量肉芽組織，無(wú)滲出。精油組皮損處可見(jiàn)中量肉芽組織，無(wú)滲出。第28天，精油組皮損處干凈無(wú)痂皮，已全愈合，并有毛發(fā)生長(zhǎng)。多磺酸粘多糖組皮損痂皮部分脫落，少許創(chuàng)面未愈合。模型組皮損大部分痂皮覆蓋，痂皮硬厚且韌性，部分創(chuàng)面愈合（圖1）。

2.2 血清TGF-β1，IL-10濃度及變化 見(jiàn)表1。治療第7天，模型組大鼠血清中TGF-β1，IL-10含量較多磺酸粘多糖組升高（P＜0.01）。與模型組比較，喜療妥外用可以提高血清中TGF-β1，IL-10含量水平（P＜0.05）。薰衣草油外用可以顯著提高血清TGF-β1，IL-10含量，較多磺酸粘多糖組和空白組均有顯著差異（P＜0.05）。治療第28天，精油組TGF-β1和IL-10基本降至正常水平，多磺酸粘多糖組稍高于正常水平，而模型組呈持續(xù)升高趨勢(shì)（P＜0.05）。

圖1 每組瘢痕形態(tài)學(xué)觀察Fig 1 The morphological observation of scar in each group

表1 薰衣草精油對(duì)深Ⅱ度燙傷小鼠血清TGF-β1，IL-10含量影響（±s，ng/m L）Tab 1 The effect of Lavender oil on the content of TGF-β1，IL-10 in mice with Ⅱ-degree deep burn（±s，ng/mL）

表1 薰衣草精油對(duì)深Ⅱ度燙傷小鼠血清TGF-β1，IL-10含量影響（±s，ng/m L）Tab 1 The effect of Lavender oil on the content of TGF-β1，IL-10 in mice with Ⅱ-degree deep burn（±s，ng/mL）

*P＜0.05與空白組比較，*＃P＜0.05與模型組比較,*&P＜0.05與多磺酸粘多糖組比較

組別 n 造模前 造模后7 d 造模后28 d TGF-β1IL-10 TGF-β1 IL-10 TGF-β1 IL-10空白組 48.48±3.70模型組129.19±10.29* 58.54±4.17* 249.80±7.35* 67.25±2.83*多磺酸粘多糖組 265.58±9.95*＃ 73.64±8.10*＃ 116.40±19.78*＃ 59.70±3.59*＃精油組 303.57±8.03*＃& 88.08±3.90*＃& 69.45±11.31*＃& 50.06±6.16*＃&6 6 1 0 64.3±9.25 10

2.3 組織中Ⅰ，Ⅲ型前膠原比值的變化 見(jiàn)表2。

表2 薰衣草精油對(duì)深Ⅱ度燙傷小鼠組織液中Ⅰ，Ⅲ型前膠原比值的影響（±s）Tab 2 The effect of Lavender oil on the content of PC Ⅰ/Ⅲin mice with Ⅱ-degree deep burn（±s）

表2 薰衣草精油對(duì)深Ⅱ度燙傷小鼠組織液中Ⅰ，Ⅲ型前膠原比值的影響（±s）Tab 2 The effect of Lavender oil on the content of PC Ⅰ/Ⅲin mice with Ⅱ-degree deep burn（±s）

*P＜0.05 與空白組比較，*＃P＜0.05 與模型組比較,*&P＜0.05 與多磺酸粘多糖組比較

組別 n 造模前 造模后7 d 造模后28 d空白組 6 1.35±0.04模型組 6 4.02±0.24* 7.31±0.47*多磺酸粘多糖組 10 3.64±0.33*＃ 2.29±0.29*＃精油組 10 3.20±0.27*＃& 1.79±0.51*＃&

治療第1天至第28天，模型組小鼠組織中Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值逐漸升高 （P＜0.05）。與模型組比較，喜遼妥外用可降低組織中Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值（P＜0.05）。薰衣草油外用可顯著降低組織中Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值，與空白組和喜遼妥組比較均具有顯著性差異（P＜0.05）。治療第28天，薰衣草油組中Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值降至正常水平。多磺酸粘多糖組仍稍高于正常水平，而模型組持續(xù)升高。

2.4 病理學(xué)檢測(cè) 見(jiàn)圖2。圖2A示正常小鼠皮膚，表皮薄，毛囊稀疏，真皮膠原稀疏。圖2B示第28天模型組小鼠皮膚表皮與毛囊增生，真皮膠原纖維增生，瘢痕增生劇烈。真皮膠原纖維化且大量成纖維細(xì)胞增殖，膠原纖維分布紊亂。圖2C示多磺酸粘多糖組28 d小鼠真皮膠原纖維增生，瘢痕增生劇烈，毛囊增生，但較模型組有所改善。圖2D示薰衣草油治療28 d小鼠創(chuàng)面表皮輕度增生，真皮膠原纖維增生顯著弱于多磺酸粘多糖組和模型組，瘢痕增生不顯著。毛囊增生，但較模型組有顯著改善。

圖2 各組小鼠皮膚病理改變（HE×40）Fig 2 Pathological changes of mice skin lesions in each group（HE×40)

2.5 顯微鏡下觀察表皮厚度、瘢痕厚度和毛囊情況 結(jié)果顯示薰衣草油外用可以顯著抑制創(chuàng)面表皮及毛囊的增生，可以顯著抑制瘢痕的形成，見(jiàn)表3～5。

表3 各組表皮厚度比較Tab 3 Comparison of epidermis thickness among four groups

表4 各組瘢痕厚度比較Tab 4 Comparison of scar thickness amony four groups

表5 各組毛囊比較Tab 5 Comparison of hair follicle amony four groups

3 討論

對(duì)于達(dá)到真皮及以下組織的損傷，機(jī)制通過(guò)瘢痕來(lái)修復(fù)。因此瘢痕是創(chuàng)傷愈合結(jié)果的一種形式[2]。深Ⅱ度燙傷是涉及皮膚表層和真皮乳頭層以下的損傷，其愈合過(guò)程分為3個(gè)時(shí)期：炎癥反應(yīng)期、肉芽組織形成期、組織重塑期。這3個(gè)時(shí)期是否能夠準(zhǔn)確精細(xì)的調(diào)節(jié)，直接影響皮膚有無(wú)瘢痕愈合方式的發(fā)生[3]。創(chuàng)傷愈合是由許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子高度影響的一系列過(guò)程。生長(zhǎng)因子TGF-β1在傷口愈合的過(guò)程中對(duì)組織重構(gòu)和再上皮化有重要作用[4]。TGF-β1調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖及成纖維細(xì)胞合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)[5-6]。血清TGF-β1在瘢痕早期增高，后逐漸降低至恢復(fù)正常水平。實(shí)驗(yàn)證明，薰衣草油外用治療可以顯著降低燙傷小鼠血清TGF-β1水平，肉眼觀察創(chuàng)面愈合完善，且無(wú)顯著瘢痕遺留，病理觀察顯示了顯著的瘢痕抑制作用。這一結(jié)果說(shuō)明精油組較早進(jìn)入愈合后期，且愈合速度高于喜遼妥組，提示薰衣草油具有縮短創(chuàng)傷愈合病程的作用。

膠原是哺乳動(dòng)物中細(xì)胞間質(zhì)的主要成分，是皮膚的支架結(jié)構(gòu)。其各類型前膠原含量及比值的變化是瘢痕組織形成的基礎(chǔ)，其中尤以Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值作用重要[7]。創(chuàng)面愈合過(guò)程中，膠原的合成和降解平衡被各種原因破壞即可形成瘢痕[8]。人體正常組織和瘢痕組織中，Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值存在顯著的變化[9]。以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)，其成分變化是瘢痕厚度和柔韌度的決定因素[10]。瘢痕組織中Ⅰ型前膠原過(guò)度分泌，皮膚膠原纖維排列紊亂，最終導(dǎo)致瘢痕形成。因此在皮膚創(chuàng)面愈合階段，Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值可作為衡量創(chuàng)面愈合情況的最佳指標(biāo)[11]。該研究中，精油組早期Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值略低于模型組，后期恢復(fù)于正常皮膚水平，說(shuō)明薰衣草油可改變組織中Ⅰ/Ⅲ型前膠原的比值，達(dá)到抑制瘢痕的作用。

喜療妥廣泛應(yīng)用于臨床，主要成分為類肝素多磺酸粘多糖，具有抗凝、抗炎和抑制瘢痕的作用。局部外用可抑制創(chuàng)面滲出，促進(jìn)血液循環(huán)和結(jié)締組織再生，及抑制透明質(zhì)酸酶活性[12-13]。肝素可對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中涉及的各類生長(zhǎng)因子的活性及與其受體結(jié)合的能力產(chǎn)生影響[14]。類肝素藥物治療深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，可有效改善血液循環(huán)，促進(jìn)膠原和肉芽組織形成，最終使創(chuàng)面愈合以及抑制損傷平面加深[15]。

薰衣草油的主要成分包括芳樟醇（34.1%）、乙酸芳樟酯（33.3%）以及乙酸薰衣草酯和薰衣草醇類（3.2%）[16]。Lis-Balchin等[17]發(fā)現(xiàn)薰衣草油具有很好的抑菌作用。炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面愈合必須經(jīng)歷的階段[18]，IL-10是白介素家族中重要的抗炎細(xì)胞因子，可通過(guò)下調(diào)炎癥介質(zhì)控制機(jī)體炎癥反應(yīng)[19-20]。目前，重組人IL-10已應(yīng)用于臨床Ⅱ期試驗(yàn)，研究其對(duì)外科手術(shù)所致創(chuàng)傷的治療作用[21]。本研究顯示小鼠外用薰衣草油治療后，早期血清中IL-10升高，后期降低至正常水平，提示其促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌，達(dá)到抗炎作用。

因此，筆者推測(cè)薰衣草油通過(guò)上調(diào)血清中TGF-β1，提高成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)膠原等細(xì)胞間質(zhì)合成，加速肉芽組織形成促進(jìn)創(chuàng)面愈合。同時(shí)通過(guò)上調(diào)血清中IL-10，控制組織炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面損傷修復(fù)和抑制瘢痕的作用。相比較喜遼妥，顯示了顯著的治療效果。筆者選擇小鼠上背部瘢痕建立模型，是因?yàn)樵撎庉^其他位置更易形成瘢痕，且避免小鼠自身搔抓撕咬及舔舐影響實(shí)驗(yàn)觀察研究。在創(chuàng)面愈合的早期階段，肉芽組織的形成至關(guān)重要。外用薰衣草油治療，使瘢痕部位形成濕潤(rùn)環(huán)境，較普通環(huán)境更利于瘢痕組織細(xì)胞修復(fù)和新生肉芽組織的生長(zhǎng)，可延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。同時(shí)薰衣草油的抗菌作用也為創(chuàng)傷組織愈合提供了良好的環(huán)境，其作為天然植物提取物無(wú)毒副作用，適合長(zhǎng)期使用。本研究證明薰衣草油對(duì)瘢痕有明確的治療作用，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了思路和理論依據(jù)。本研究尚存不足，若能夠嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)材料和改良造模設(shè)備，恰當(dāng)延長(zhǎng)治療時(shí)間，則能夠更全面深入地了解薰衣草油在創(chuàng)面愈合和瘢痕形成中的作用。此外，為什么薰衣草油可在28天內(nèi)顯著改變血清中TGF-β1、IL-10和組織中Ⅰ/Ⅲ型前膠原比值?薰衣草油為何對(duì)I型和Ⅲ型前膠原的表達(dá)影響存在差異?針對(duì)成纖維細(xì)胞，薰衣草油是否能產(chǎn)生影響？這些問(wèn)題均可作為未來(lái)深入研究探討的方向，從而全面而深刻地認(rèn)識(shí)創(chuàng)面愈合和瘢痕形成過(guò)程。