張 鵬，馮小云，杜 芹，，田 鯤，

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610072)

牙體缺損是口腔常見(jiàn)疾病之一，可能會(huì)影響到咬合功能、鄰接關(guān)系等，若缺損層次深在，甚至?xí)绊懷浪?、牙周組織健康，妨礙生長(zhǎng)發(fā)育、面部美觀[1]。目前臨床治療牙體缺損的方法主旨是運(yùn)用形/質(zhì)相近的材料(金屬、樹(shù)脂、玻璃離子、陶瓷等)進(jìn)行充填，但材料始終存在密合度不高、易出現(xiàn)微滲漏引發(fā)繼發(fā)齲等問(wèn)題。研究表明，流動(dòng)樹(shù)脂和玻璃離子充填齦下齲成功率分別為91.9% 、75.8%[2]。牙釉質(zhì)羥基磷灰石的形成和生長(zhǎng)都受組織中相關(guān)蛋白調(diào)控，釉基質(zhì)蛋白為蛋白混合物，能有效誘導(dǎo)釉質(zhì)定向礦化[3，4]，近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)可以利用有機(jī)大分子為模板引導(dǎo)牙體組織礦化實(shí)現(xiàn)微量組織修復(fù)，如釉原蛋白在疏水作用下自組裝成納米球，緊密?chē)@在微晶周?chē)纬纱闃咏Y(jié)構(gòu)[5]，這是羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[6]，決定了之后羥基磷灰石晶體的生長(zhǎng)取向和形態(tài)[7～9]。據(jù)研究表明，釉成熟蛋白可能參與了釉質(zhì)發(fā)育初始階段礦化晶核的形成[12]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究釉成熟蛋白對(duì)釉質(zhì)晶體生長(zhǎng)的誘導(dǎo)和調(diào)控能力。

1 材料與方法

1.1材料本實(shí)驗(yàn)采用2014年8月正畸兒童預(yù)防性拔出的第三恒磨牙牙胚2個(gè)(圖1)，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科提供，經(jīng)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全部調(diào)查和取樣均征得受試者及其監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書(shū)。

圖1 正畸兒童曲面體層片(箭頭示第三恒磨牙)

1.2方法

1.2.1成熟蛋白的獲取方法 從上述牙囊中提取牙胚細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增得到釉成熟蛋白cDNA。使用限制性內(nèi)切酶剪切得到釉成熟蛋白全長(zhǎng)基因，將其與pMD18-T載體相連構(gòu)建質(zhì)粒，以大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)得到釉成熟蛋白。

1.2.2牙片的制備 將收集的新鮮離體牙(牙冠完整、無(wú)破損)用低速手機(jī)在生理鹽水沖洗冷卻下切割、打磨制備為直徑約10 mm，厚約1 mm左右的牙片，依次用800、1000、1200、1500、2000目的砂紙打磨，37%磷酸酸蝕1 min(余留少許牙片不酸蝕)，去污劑、丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用。

1.2.3釉成熟蛋白溶液配制 在冰上用50 mMTris-HCl(pH=7.6)將2 mg/ml的釉成熟蛋白儲(chǔ)存液稀釋至100 μg/ml，與此同時(shí)，釉成熟蛋白液的PH值也由3.5變?yōu)?.6，然后再室溫孵育以備用。

1.2.4礦化液配制 礦化液由3.0 mM CaCl2、180 mMNaCl、1.5 mMKH2PO4、50 mMTris-HCl(pH=7.6)配制而成[10]，0.1 MHC1和0.1 MNaOH調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.6。礦化液配制完成后需立即使用。

1.2.5釉成熟蛋白誘導(dǎo)礦化 本實(shí)驗(yàn)采用玻片及上述牙片作為樣本，按處理方法分為5組(表1)：組1為玻片，依次用去污劑、丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用；組2為牙片，僅切割后用砂紙打磨后用去污劑、丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用(未酸蝕)；組3～5為牙片，切割、砂紙打磨、37%磷酸酸蝕1 min后用去污劑、丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用。組1、5為實(shí)驗(yàn)組，用于觀察有無(wú)釉成熟蛋白引導(dǎo)礦化、以及釉成熟蛋白在牙片上與玻片上引導(dǎo)礦化的區(qū)別，組2、3、4為對(duì)照組，用于觀察正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)及無(wú)釉成熟蛋白引導(dǎo)的礦化產(chǎn)物。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及試劑

將組1的玻片和組5的牙片先置于1 ml釉成熟蛋白液中室溫孵育30 min，再轉(zhuǎn)移至10 ml新鮮配制的礦化液中，密封后置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)孵育，每24 h更換一次礦化液(新鮮配制)，每天取樣觀察，以評(píng)估時(shí)間與釉成熟蛋白引導(dǎo)礦化的關(guān)系；組4的牙片直接放置于10 ml新鮮配制的礦化液中，密封后置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)孵育，每24 h更換一次礦化液(新鮮配制)兩周后取出樣本；組2、3超聲清洗干燥后不做任何處理。將各組樣本通過(guò)導(dǎo)電膠固定在試樣品臺(tái)上，噴金60 s后，放入掃描電鏡真空室進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

在光滑玻片上，釉成熟蛋白能誘導(dǎo)能形成“串珠樣”結(jié)構(gòu)，并交織成網(wǎng)狀，但所形成的產(chǎn)物只是沿著玻片表面生長(zhǎng)，且平均粒徑較小(圖2a)。圖2b為僅打磨、超聲清洗后牙片，可見(jiàn)正常釉柱結(jié)構(gòu)，甚至可透過(guò)裂紋看見(jiàn)羥基磷灰石纖維。正常牙齒酸蝕后經(jīng)掃描電鏡觀察可見(jiàn)釉柱頭尾相接所形成的“網(wǎng)拍狀”結(jié)構(gòu)(圖2c)。將牙片浸泡在單純的礦化液中并37 ℃恒溫孵育14天，在牙片的表面形成了一層形狀不規(guī)則的片狀礦化產(chǎn)物(圖2d、e、f)，礦化產(chǎn)物呈平面型，雜亂無(wú)章地覆蓋在釉質(zhì)表面，未見(jiàn)平行于釉柱c軸的立體結(jié)構(gòu)。將牙片浸泡在釉成熟蛋白和礦化液中37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3天可見(jiàn)“網(wǎng)拍狀”的釉質(zhì)結(jié)構(gòu)表面生長(zhǎng)出了“串珠樣”的礦化產(chǎn)物，并沿著釉柱c軸呈立體結(jié)構(gòu)，平均粒徑較小，且產(chǎn)物稀疏(圖2g)；14天可見(jiàn)“網(wǎng)拍狀”的表面已被礦化產(chǎn)物填補(bǔ)起來(lái)，在縫隙處可見(jiàn)“串珠樣”產(chǎn)物的粒徑增大、長(zhǎng)度增加(圖2h、i)，相對(duì)于第3天更加密集。

在未添加釉成熟蛋白的對(duì)照組中，組4相比于組2、組3，能形成再礦化產(chǎn)物，但羥基磷灰石微晶尚且不能形成，所以礦化產(chǎn)物呈平面型，雜亂無(wú)章地覆蓋在釉質(zhì)表面，未見(jiàn)平行于釉柱c軸的立體結(jié)構(gòu)。而組1，即使在光滑玻片上，也能形成“串珠樣”結(jié)構(gòu)，并交織成網(wǎng)狀，但所形成的產(chǎn)物只是沿著玻片表面生長(zhǎng)，且平均粒徑相對(duì)于第5組礦化產(chǎn)物較小。而比較組5與組4，釉成熟蛋白能誘導(dǎo)形成沿釉柱c軸的礦化產(chǎn)物，可能為羥基磷灰石微晶，且粒徑、長(zhǎng)度、密度都隨時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，符合粒徑長(zhǎng)大的物理機(jī)制。

圖2 掃描電子顯微鏡形貌表征：a：組1，添加釉成熟蛋白的玻片礦化14天；b：組2，正常釉柱結(jié)構(gòu)；c：組3，酸蝕后釉柱結(jié)構(gòu)；d、e、f：組4，無(wú)釉成熟蛋白引導(dǎo)的礦化；g、h、i：組5，釉成熟蛋白引導(dǎo)的礦化

3 討論

牙釉質(zhì)由六方形的羥基磷灰石晶體構(gòu)成，且這些晶體具有平行于釉質(zhì)c軸的擇優(yōu)取向，這是釉質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)；羥基磷灰石晶體再礦化形成納米級(jí)纖維，構(gòu)成釉質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；互相平行的納米纖維聚集形成微纖維，組成三級(jí)結(jié)構(gòu)；微纖維沿長(zhǎng)軸(c軸)平行排列，進(jìn)一步組裝構(gòu)成更粗的纖維束，這是釉質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)；釉柱的第五級(jí)分級(jí)結(jié)構(gòu)是釉柱和釉柱間質(zhì)，這是釉質(zhì)的主要承力結(jié)構(gòu)；釉柱和間質(zhì)是由兩種不同取向的纖維束組裝而成，二者互成一定角度，在釉質(zhì)表面 1 /3層內(nèi)，釉柱以放射狀方式排列，在內(nèi) 2 /3層則以交叉方式排列；這些排列結(jié)構(gòu)是釉質(zhì)的第六級(jí)結(jié)構(gòu)；釉質(zhì)以不同的排列方式，最后覆蓋整個(gè)牙冠，形成釉質(zhì)的七級(jí)結(jié)構(gòu)[14]。見(jiàn)圖3。

圖3 人牙釉質(zhì)的七級(jí)分級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖[11]

圖4 羥基磷灰石結(jié)構(gòu)示意圖[12] a：立體結(jié)構(gòu)，b：平面結(jié)構(gòu)

沿羥基磷灰石c軸自上而下投影可見(jiàn)晶胞中央為OH-，周?chē)鸀?個(gè)Ca2+，分為兩層，形成兩個(gè)平行的三角形，a1=a2=0.9432 nm，a軸互成120度夾角，c軸與a軸垂直[12](圖4)。所以要想模擬正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行礦化必須模擬羥基磷灰石的排列以及釉柱與間質(zhì)的結(jié)構(gòu)。在釉質(zhì)的發(fā)育過(guò)程中，由釉原蛋白自組裝形成帶負(fù)電荷的納米小球，引導(dǎo)牙釉質(zhì)成核和定向生長(zhǎng)，逐級(jí)形成釉質(zhì)結(jié)構(gòu)；在釉質(zhì)成熟之前，帶負(fù)電的納米小球與羥基磷灰石晶面相互作用，防止晶體聚合；在進(jìn)一步的生長(zhǎng)過(guò)程中，釉基質(zhì)蛋白降解為小分子蛋白控制釉質(zhì)的生長(zhǎng)和取向[13，14]，具體作用為帶有負(fù)性電荷的釉基質(zhì)蛋白納米微球通過(guò)靜電作用吸附在與羥基磷灰石c軸平行的晶體表面，暫時(shí)封閉b、c面，穩(wěn)定羥基磷灰石晶體，使羥基磷灰石微晶沿裸露的羥基磷灰石晶體c軸擇優(yōu)性生長(zhǎng)[12，15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，在四種釉基質(zhì)基因中，釉成熟蛋白基因是唯一在蜥蜴與小鼠的釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中于結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式中顯示出明顯差異的基因，由于釉基質(zhì)蛋白在釉質(zhì)結(jié)構(gòu)及其礦化中所起的重要作用，所以該研究認(rèn)為釉成熟蛋白基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)的變化可能與從非哺乳動(dòng)物的非晶體釉質(zhì)結(jié)構(gòu)到哺乳動(dòng)物的晶體釉質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。釉成熟蛋白作為釉基質(zhì)蛋白中的一種，含磷酸鈣結(jié)合位點(diǎn)，能促進(jìn)磷酸鈣礦化，且據(jù)研究表明，在小鼠牙胚發(fā)育過(guò)程釉成熟蛋白的時(shí)空表達(dá)研究中，成釉蛋白可能參與了釉質(zhì)發(fā)育初始階段礦化晶核的形成[17]。成釉蛋白誘導(dǎo)進(jìn)行礦化所形成的產(chǎn)物最初為納米小球，隨著時(shí)間變長(zhǎng)，納米小球慢慢形成串珠樣結(jié)構(gòu)且平行與釉柱的c軸。時(shí)間越長(zhǎng)，串珠樣結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度越長(zhǎng)、粒徑越大。這種結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是形成平行排列羥基磷灰石晶體的分子基礎(chǔ)[7～9]，即羥基磷灰石微晶。在玻片上，釉成熟蛋白誘導(dǎo)礦化也能形成串珠樣結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，但并不能垂直于玻片平面生長(zhǎng)，粒徑小，僅能覆蓋在玻片表層(圖2a)，在無(wú)釉成熟蛋白誘導(dǎo)的礦化中，礦化產(chǎn)物僅能堆積在牙片表面，不能形成立體結(jié)構(gòu)(圖2d、e、f)。而在牙片上(圖2h、i)串珠樣結(jié)構(gòu)卻能平行于釉柱c軸、垂直于牙片平面生長(zhǎng)，可能由于釉成熟蛋白帶負(fù)性電荷，通過(guò)靜電作用吸附在與羥基磷灰石c軸平行的晶體表面，然后納米微球組裝成較大的微球，與b、c晶面發(fā)生靜電相互作用，從而暫時(shí)封閉b、c面，穩(wěn)定羥基磷灰石晶體，使羥基磷灰石微晶沿裸露的羥基磷灰石晶體表面繼續(xù)生長(zhǎng)[10，11]，相互平行的串珠棒狀晶體模擬了平行排列的釉柱，特征串珠結(jié)構(gòu)證實(shí)釉成熟蛋白在釉質(zhì)生長(zhǎng)過(guò)程中的重要作用。

釉成熟蛋白能誘導(dǎo)形成平行于釉柱c軸、垂直于牙片平面的串珠棒狀晶體產(chǎn)物，說(shuō)明釉成熟蛋白在釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中起著引導(dǎo)羥基磷灰石晶體沿著釉柱c軸擇優(yōu)性生長(zhǎng)的重要作用。

本實(shí)驗(yàn)所形成的礦化產(chǎn)物的量比較少，并且尚未測(cè)量其硬度，無(wú)法評(píng)估其強(qiáng)度，且實(shí)驗(yàn)周期短，尚不能知曉長(zhǎng)期鈣化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及方向。望在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中能延長(zhǎng)礦化實(shí)驗(yàn)時(shí)間，且采用合適的方法評(píng)估其硬度、強(qiáng)度，以便今后有希望能將生物再礦化的方式用于牙體缺損的修復(fù)。