晨 凡,秦鮮菊,徐思源,寧喜斌,2,3,4,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.上海海洋大學(xué),食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306; 3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 4.國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心(上海),上海 201306)

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一,在世界食品安全領(lǐng)域中備受關(guān)注。世界衛(wèi)生組織(WHO)最新研究報(bào)告表明,在2015年全球有5600多萬(wàn)人死亡,其中約有139萬(wàn)人死于腹瀉病[1]。在眾多食源性致病菌中,沙門氏菌與副溶血性弧菌最受關(guān)注。2008～2015年間,我國(guó)共有1597起食物中毒事件,其中由食源性致病菌引起的食物中毒占總中毒人數(shù)的62.02%,而在所有致病菌中,沙門氏菌和副溶血性弧菌分別在常見(jiàn)微生物食物中毒占比23%和21%,分別為第一和第二位[2-3]。

近年來(lái),在食源性致病菌快速檢測(cè)方面,檢測(cè)方法主要涉及免疫學(xué)、代謝學(xué)、以DNA探針等技術(shù)為代表的分子生物學(xué)等,較之傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法檢測(cè),具有較高的特異性和靈敏性?，F(xiàn)代技術(shù)如多重PCR、基因芯片等,甚至可以實(shí)現(xiàn)同一平臺(tái)上對(duì)多種致病菌的檢測(cè)[4-7]。同時(shí),檢測(cè)方法的快速發(fā)展也要求樣品前處理步驟更加快捷,在食源性致病菌的檢測(cè)過(guò)程中,仍需要對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，但是不同的致病菌有特定的前增菌步驟,沙門氏菌等菌株更是需要進(jìn)行多步增菌過(guò)程,較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力[8]。因此,研制可同時(shí)富集多種致病菌的共增菌培養(yǎng)基成為研究的熱點(diǎn),這對(duì)于提高致病菌共檢技術(shù)的效率具有重要意義。沙門氏菌和副溶血性弧菌均為食品中重要的致病菌,研究其共增菌技術(shù)對(duì)于控制其疾病的傳播及預(yù)防相應(yīng)的食物中毒具有重大意義。

目前國(guó)內(nèi)外研究中,涉及多種致病菌共增菌培養(yǎng)基的研究已有:沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的共增技術(shù)[9],沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的共增技術(shù)[10],沙門氏菌、大腸桿菌和單增李斯特氏菌的共增技術(shù)[11],沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的共增技術(shù)[12]等,其中大部分培養(yǎng)基選擇性增菌能力不強(qiáng),不能滿足對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行富集的要求。翁思聰?shù)萚13]研究了一種選擇性富集沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培養(yǎng)基,由于其共增菌的菌株種類較多,菌株間存在較為復(fù)雜的抑制和共生關(guān)系,容易影響檢出效率和重復(fù)率。沙門氏菌和副溶血弧菌均為革蘭氏陰性菌,需氧或兼性厭氧,營(yíng)養(yǎng)需求不高,且兩種細(xì)菌均可利用葡萄糖、檸檬酸和甘露醇作為碳源,因此可在同種培養(yǎng)條件下迅速生長(zhǎng),兩者在同一選擇性增菌環(huán)境中共增菌具有現(xiàn)實(shí)的可行性,且更具有針對(duì)性。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)富集沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種引起食源性疾病致病菌的共增菌培養(yǎng)基進(jìn)行了研究,對(duì)其增菌效果進(jìn)行了初步的評(píng)估驗(yàn)證,并根據(jù)目標(biāo)菌不同的營(yíng)養(yǎng)需求,篩選適宜抑制劑和促進(jìn)劑,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),確定共增菌培養(yǎng)基的配方,最后驗(yàn)證該培養(yǎng)基的增菌效果,以得到具有較優(yōu)增菌效果的共增菌培養(yǎng)基,為今后檢測(cè)方法的修訂提供必要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，Se)CMCC 15611、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，Vp)ATCC 13847 均為本研究室保藏;營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 分析純,用于食品及其他物品檢驗(yàn)中的菌落計(jì)數(shù)(上海疾控)上海華康科技開發(fā)公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(Xylose lysine deoxycholate agar,XLD) 分析純,用于沙門氏菌的選擇性分離，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar,TCBS) 分析純,用于致病性弧菌的選擇性分離，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;蛋白胨 分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司;磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)、氯化鈉、葡萄糖、甘露醇 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛膽鹽 分析純，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床、THZ-300隔水式培養(yǎng)箱9270 上海一恒科技有限公司;InoLab pH730臺(tái)式pH測(cè)量?jī)x 德國(guó)WTW公司;UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇 參照沙門氏菌、副溶血性弧菌在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013中規(guī)定的增菌培養(yǎng)基配制方法,分別列出其中的成分及含量,參考劉園園等[12]方法,去除培養(yǎng)基中具有選擇性的組分,并根據(jù)兩種細(xì)菌生長(zhǎng)所必要的成分確定共增菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。

1.2.2 共增菌培養(yǎng)基中單因素成分的篩選 根據(jù)兩種細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需求和抑制條件的不同,參考之前的研究[11-12]和兩種目標(biāo)菌各自選擇培養(yǎng)基中的特異成分,篩選不同的抑制劑和促進(jìn)劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將添加成分列為:葡萄糖、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、甘露醇、氯化鈉、牛膽鹽。根據(jù)方法1.2.1配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,取四支試管編號(hào)1～4號(hào),其中1號(hào)試管作為空白對(duì)照,只加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基4 mL,2、3、4號(hào)試管分別加入含低濃度、中濃度、高濃度添加成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基4 mL(見(jiàn)表2),分裝后高壓滅菌備用。將沙門氏菌和副溶血性弧菌分別接入不同添加成分的培養(yǎng)基中,在37 ℃,120 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定在600 nm波長(zhǎng)處的光密度OD值,以此確定適宜添加成分及適宜添加量,制備共增菌培養(yǎng)基。

1.2.3 目標(biāo)菌增菌效果的驗(yàn)證 以102CFU/mL作為目標(biāo)菌初始接種量,將沙門氏菌及副溶血性弧菌分別接種至共增菌培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。分別取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時(shí)的菌液1 mL,加入9 mL生理鹽水中,制成1∶10稀釋液,以此類推,分別進(jìn)行適宜梯度稀釋,每個(gè)梯度平行三次,平板涂布至XLD及TCBS培養(yǎng)基中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,對(duì)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),得出總菌落數(shù),繪制目標(biāo)菌生長(zhǎng)曲線并分析結(jié)果。由于營(yíng)養(yǎng)肉湯沒(méi)有特定選擇性,且沙門氏菌和副溶血性弧菌均可在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng),故以營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌液作為對(duì)照組,重復(fù)上述操作,得出對(duì)照組生長(zhǎng)曲線。并以102CFU/mL為初始接種量,將沙門氏菌及副溶血性弧菌以1∶1比例一同接種至共增菌培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h并稀釋涂布平板,觀察目標(biāo)菌生長(zhǎng)情況并計(jì)算菌落總數(shù),實(shí)驗(yàn)平行三次,同樣以營(yíng)養(yǎng)肉湯作為對(duì)照組,驗(yàn)證培養(yǎng)基共增菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),對(duì)培養(yǎng)基不同成分添加后目標(biāo)菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行單因素顯著性差異分析,對(duì)目標(biāo)菌在共增菌培養(yǎng)基及對(duì)照組中的增菌情況進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn),進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

根據(jù)GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013,對(duì)目標(biāo)菌增菌培養(yǎng)基成分進(jìn)行比較,結(jié)果如表1所示。由表1分析可知,蛋白胨為沙門氏菌和副溶血性弧菌提供氮源和能源,參照國(guó)標(biāo)，其含量取10.0 g為宜,氯化鈉在增菌液中起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用,而磷酸二氫鉀的添加可以穩(wěn)定菌體生長(zhǎng)過(guò)程中pH的變化[10],綜合考慮兩種目標(biāo)菌的基本生長(zhǎng)條件及配制簡(jiǎn)便性,取氯化鈉5.0 g,磷酸氫二鉀1.5 g為適宜含量,得出共增菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分為:蛋白胨10.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,氯化鈉5.0 g,蒸餾水1000 mL。將以上成分進(jìn)行分裝,振蕩搖勻,調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4,于1×105Pa高溫滅菌15 min后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 目標(biāo)菌增菌培養(yǎng)基成分比較Table 1 Comparison of enrichment medium compositions of target bacteria

2.2 共增菌培養(yǎng)基添加成分及含量

添加抑制劑和促進(jìn)劑的增菌液按濃度從低到高進(jìn)行排列,成分及添加濃度如表2所示。

表2 各添加成分及其添加量Table 2 Additive amount of different candidate agents

將目標(biāo)菌接種培養(yǎng)后,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,沙門氏菌的OD600值為0.523±0.014,副溶血性弧菌的OD600值為0.332±0.007,以此作為空白對(duì)照。在添加不同成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,兩種目標(biāo)菌的OD600值如表3所示。

表3 各添加成分對(duì)兩種目標(biāo)菌生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of different candidate agents on the growth of two target bacterias

對(duì)抑制劑單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,硫代硫酸鈉的添加對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長(zhǎng)均起到明顯的作用。當(dāng)硫代硫酸鈉的添加量不大于5.0 g/L時(shí),沙門氏菌受到顯著促進(jìn)作用,而副溶血性弧菌受到顯著抑制作用(p<0.05),當(dāng)硫代硫酸鈉添加量達(dá)到10.0 g/L時(shí),沙門氏菌和副溶血性弧菌均受到顯著的抑制作用,綜合考慮,硫代硫酸鈉的適宜添加量為5.0 g/L。不同濃度的氯化鈉對(duì)兩種目標(biāo)菌的作用不同。對(duì)于沙門氏菌而言,氯化鈉濃度越高,對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng),而氯化鈉濃度為2%～4%時(shí),對(duì)副溶血性弧菌的生長(zhǎng)最為適宜[15]。當(dāng)氯化鈉添加量為2.5 g/L時(shí),由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中已添加5.0 g/L氯化鈉,此時(shí)氯化鈉的總濃度為7.5 g/L,沙門氏菌OD值為0.703±0.013,副溶血性弧菌為0.721±0.009,兩種目標(biāo)菌的生長(zhǎng)較對(duì)照組顯著增加(p<0.05);但當(dāng)氯化鈉添加量為5.0 g/L,總濃度達(dá)10.0 g/L時(shí),沙門氏菌的OD值降到0.450±0.008,其生長(zhǎng)受到顯著抑制(p<0.05),由此可知,為了使沙門氏菌和副溶血性弧菌在相同增菌時(shí)間內(nèi)均達(dá)到檢測(cè)限,氯化鈉濃度不能達(dá)到副溶血性弧菌最適濃度,適宜添加量為2.5 g/L。牛膽鹽作為一種革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)抑制劑[16],在0.1 g/L以下的濃度時(shí),對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌等革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)的影響不大,但高于此濃度會(huì)使抑制作用顯著增強(qiáng)(p<0.05),因此0.1 g/L為牛膽鹽的適宜添加量。

對(duì)促進(jìn)劑單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,檸檬酸鈉在1.25～2.5 g/L濃度范圍內(nèi),可以促進(jìn)沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長(zhǎng),但當(dāng)添加量達(dá)到5.0 g/L時(shí),其促進(jìn)作用不顯著(p>0.05),表明檸檬酸鈉的促進(jìn)作用有限,其適宜添加量為2.5 g/L。在1.25～5.0 g/L濃度范圍內(nèi),相較對(duì)照組,甘露醇對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌有顯著的促進(jìn)作用(p<0.05)。當(dāng)添加量為5.0 g/L時(shí),甘露醇對(duì)沙門氏菌仍有顯著的促進(jìn)作用(p<0.05),但對(duì)副溶血性弧菌的促進(jìn)作用不顯著(p>0.05)。葡萄糖作為一種碳源,其添加對(duì)兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)均可起到一定程度的促進(jìn)作用[17],根據(jù)表中結(jié)果分析,葡萄糖最適宜的添加量為2.5 g/L,此濃度對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌的促進(jìn)效果均顯著。

綜上所述,最終確定共增菌培養(yǎng)基的添加成分及其含量為:蛋白胨10.0 g、磷酸二氫鉀1.5 g、氯化鈉7.5 g、硫代硫酸鈉5.0 g、牛膽鹽0.1 g、檸檬酸鈉2.5 g、甘露醇2.5 g、葡萄糖2.5 g、1000 mL蒸餾水。配制后充分混勻,調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4。將該培養(yǎng)基命名為SV(Salmonella-Vibrioparahaemolyticus)富集培養(yǎng)基。

2.3 目標(biāo)菌在共增菌培養(yǎng)基中增菌效果的驗(yàn)證

沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(對(duì)照組)中分別增菌的結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 沙門氏菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯(對(duì)照) 和SV增菌液中24 h內(nèi)生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of Salmonella in nutritional broth(control)and SV broth within 24 h

圖2 副溶血性弧菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯(對(duì)照) 和SV增菌液中24 h內(nèi)生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of Vibrio parahaemolyticus in nutritional broth and SV broth within 24 h

由圖1可知,較高氯化鈉濃度造成的高滲環(huán)境對(duì)沙門氏菌的生長(zhǎng)起到抑制作用,沙門氏菌在SV培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率略慢,生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期相對(duì)于對(duì)照組滯后。

表4列出了沙門氏菌在兩種培養(yǎng)基中每4 h時(shí)的菌濃度,由表中數(shù)據(jù)分析可知,在SV培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h時(shí),沙門氏菌達(dá)到最高生長(zhǎng)濃度可達(dá)108CFU/mL,與對(duì)照組109CFU/mL存在顯著性差異(p<0.05),表明沙門氏菌在SV增菌液中增菌效果低于對(duì)照組。

表4 沙門氏菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯(對(duì)照)和SV增菌液中生長(zhǎng)差異性比較Table 4 Comparison of Salmonella growth differences in nutritional broth(control)and SV broth

與沙門氏菌相比,副溶血性弧菌受到鹽濃度的抑制作用較小,由圖2可知,副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),約2 h就能進(jìn)入對(duì)數(shù)期,且在增菌10 h時(shí)菌濃度達(dá)到最高值,相比對(duì)照組增效明顯,表明SV增菌液比對(duì)照組更適于Vp。

表5中數(shù)據(jù)顯示,在4、8 h時(shí),SV培養(yǎng)基中的菌液濃度同對(duì)照組比,存在顯著性差異(p<0.05),當(dāng)增菌時(shí)間到達(dá)16 h時(shí),SV增菌液和對(duì)照組中菌液濃度均達(dá)到109CFU/mL,差異不顯著性(p>0.05),表明副溶血性弧菌在SV增菌液中增菌效率比對(duì)照組高。

表5 副溶血性弧菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯(對(duì)照)和SV增菌液中生長(zhǎng)差異性比較Table 5 Comparison of Vibrio parahaemolyticus growth differences in nutritional broth(control)and SV broth

將沙門氏菌及副溶血性弧菌以1∶1比例一同接種至SV培養(yǎng)基及營(yíng)養(yǎng)肉湯中,經(jīng)過(guò)24 h增菌培養(yǎng)后,沙門氏菌菌落總數(shù)可達(dá)到107CFU/mL,副溶血性弧菌菌落總數(shù)可達(dá)到108CFU/mL(見(jiàn)圖3),相比對(duì)照組,沙門氏菌在增菌24 h后菌濃度可達(dá)到107CFU/mL,而副溶血性弧菌在增菌24 h后菌濃度為106CFU/mL,表明SV培養(yǎng)基對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌效果優(yōu)于營(yíng)養(yǎng)肉湯。較翁思聰?shù)萚13]研究結(jié)果中,沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基中共同增菌時(shí)生長(zhǎng)更為旺盛,可達(dá)到后續(xù)檢測(cè)的檢測(cè)限。

圖3 沙門氏菌和副溶血性弧菌在SV培養(yǎng)基 及對(duì)照組中共增菌生長(zhǎng)情況Fig.3 Simultaneous growth of Salmonella and Vibrio parahaemolyticus in SV broth and control broth

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013中沙門氏菌和副溶血性弧菌選擇性增菌液成分的篩選以及兩種目標(biāo)菌營(yíng)養(yǎng)需求的分析配制了合適的基礎(chǔ)增菌液,并對(duì)共增培養(yǎng)基中促進(jìn)劑和抑制劑進(jìn)行了篩選,最終配制出可同時(shí)富集沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌SV培養(yǎng)基。本研究中的兩種目標(biāo)菌均為革蘭氏陰性細(xì)菌,因而在設(shè)計(jì)SV培養(yǎng)基時(shí),添加了硫代硫酸鈉、牛膽鹽等革蘭氏陽(yáng)性菌抑制劑,同時(shí)添加適宜濃度的氯化鈉,使兩種目標(biāo)菌能以相對(duì)一致的速度生長(zhǎng)。檸檬酸鈉、甘露醇、葡萄糖等可作為細(xì)菌的生長(zhǎng)因子,對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。本研究中對(duì)照組營(yíng)養(yǎng)肉湯NB為通用型肉湯培養(yǎng)基,無(wú)法實(shí)現(xiàn)幾種目標(biāo)菌的共同增菌[18],且國(guó)標(biāo)中各個(gè)菌株的選擇性增菌液只能滿足單一菌種的增菌,而SV培養(yǎng)基可同時(shí)對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種目標(biāo)菌進(jìn)行富集,成分相對(duì)簡(jiǎn)單,配制簡(jiǎn)易,針對(duì)性較強(qiáng)。同時(shí)可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究目標(biāo)菌的多重PCR等技術(shù),實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的需求。

本研究結(jié)果表明,研制出用于沙門氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培養(yǎng)基成分為:蛋白胨10.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,氯化鈉7.5 g,硫代硫酸鈉5.0 g,牛膽鹽0.1 g,檸檬酸鈉2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸餾水1000 mL。當(dāng)目標(biāo)菌初始濃度為102CFU/mL時(shí),將沙門氏菌與副溶血性弧菌以1∶1比例接種至SV培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,菌濃度可分別達(dá)到107CFU/mL和108CFU/mL,其共增菌效果優(yōu)于營(yíng)養(yǎng)肉湯。本研究研制的SV共增菌培養(yǎng)基可同時(shí)富集沙門氏菌和副溶血性弧菌兩種目標(biāo)菌,滿足目標(biāo)菌檢測(cè)的要求,且增菌培養(yǎng)基成分相對(duì)簡(jiǎn)單,成本較低,具有良好的市場(chǎng)前景,也為今后檢測(cè)方法的修訂提供了一定的依據(jù)。