周彥宏,李虹甫,陳思涵,林官根,劉昕宇,滿朝新,徐紅華,姜毓君

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

早期腸道菌群的定植很大程度上影響人體成年后的腸道菌群結(jié)構(gòu),而嬰兒時(shí)期為腸道菌群定植的關(guān)鍵時(shí)期[1-2]。乳酸菌作為早期腸道菌群的主要組成部分,其多樣性及豐度與嬰兒腸道健康狀況密切相關(guān)[3]。除生產(chǎn)及喂養(yǎng)方式外,早期抗生素干預(yù)一定程度上也會(huì)影響早期嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)[4-6]?？股卦诠粲泻簳r(shí),包括乳酸菌在內(nèi)的一些有益菌群也會(huì)遭受影響,且會(huì)促使某些細(xì)菌抗性基因的表達(dá)[7]。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可對腸道中獲得的單一細(xì)菌菌株進(jìn)行培養(yǎng),有助于全面、完整地研究該種細(xì)菌的功能和不同生長條件下的生理活性[8]。應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離腸道菌群，不僅有助于揭示腸道細(xì)菌對營養(yǎng)成分的利用情況和細(xì)菌之間的相互作用,且分離得到的乳酸菌菌株，可作為今后人源益生菌菌株篩選的潛在資源。但傳統(tǒng)培養(yǎng)方法也仍存在很多的局限性與不足之處。除絕大多數(shù)腸道菌群不可培養(yǎng)外,體外培養(yǎng)體系也很難完全模擬微生物在腸道中自然生長繁殖的條件。隨著以16S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)發(fā)展,一些不依賴于培養(yǎng)的技術(shù)被應(yīng)用于腸道菌群的研究,如Real time-PCR、DGGE、FISH和以Illumina高通量測序技術(shù)為首的第二代測序技術(shù)[9-12]。盡管這些方法可一定程度上提供更豐富的腸道菌群結(jié)構(gòu)信息,但其費(fèi)用高且耗時(shí),有些研究手段只能檢測出一定豐度上或處于低等分類學(xué)水平的菌群?；赑acBio Sequel平臺(tái)的單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)，能夠彌補(bǔ)上述核酸檢測技術(shù)的缺陷,可對16S rDNA全長進(jìn)行測序,更準(zhǔn)確探究腸道菌群多樣性和實(shí)現(xiàn)種水平上的深度分類[13]。然而,僅基于核苷酸序列的三代測序技術(shù)準(zhǔn)確率稍低,不能分辨糞便樣品中的死活菌,且無法獲得單一菌株進(jìn)行后續(xù)生理生化及功能特性分析。因此,將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與三代測序技術(shù)相結(jié)合,不僅可獲得單一純化的乳酸菌,也可更準(zhǔn)確地獲悉腸道糞便樣品中的微生物多樣性。

本文采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與單分子實(shí)時(shí)三代測序技術(shù)結(jié)合的方法,對中國嬰兒腸道菌群中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定及多樣性分析,且探究了抗生素對乳酸菌多樣性的影響。通過對嬰兒腸道菌群中乳酸菌的分離及多樣性的探究,為后續(xù)人源益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供菌種資源,并為嬰兒健康發(fā)展提供有效技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8份嬰兒腸道糞便樣品 通過問卷調(diào)查方式,選取符合實(shí)驗(yàn)要求的8份嬰兒腸道糞便樣品。根據(jù)是否在采樣前后4周內(nèi)接受抗生素治療及抗生素種類分為阿莫西林組(A組,共2份)、美羅培南組(B組,共2份)和健康組(H組,共4份),嬰兒選取標(biāo)準(zhǔn):母親無慢性基礎(chǔ)疾病(包括糖尿病,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或慢性傳染病及心肺疾病)及家族遺傳病，除是否接受抗生素治療外,胎兒胎齡、出生體重、生產(chǎn)及喂養(yǎng)方式等均無明顯差異；MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;2×Taq PCR MasterMix 北京天根生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司;QIAamp DNA Stool Mini Kit 德國QIAGEN公司。

RL-58GSP型低溫采樣箱 北京優(yōu)冷科技有限公司;YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;厭氧產(chǎn)氣袋 日本三菱化學(xué)有限公司;BXM-30R型高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Bcn1360型生物超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造;3K-15型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;7000 PCR擴(kuò)增儀 美國Applied Biosystems公司;DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠;UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國Thermo分光光度計(jì)公司;XW-80A型渦旋混勻器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器制造廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嬰兒腸道糞便樣品的采集 在嬰兒自然排便后,使用無菌采樣管進(jìn)行樣品采集,采集過程中均為無菌操作。采集后立即放入低溫采樣箱中速凍,在2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室,其中一部分立即進(jìn)行菌株分離,另一部分置于-80 ℃保存,用于糞便樣品總DNA提取。

1.2.2 乳酸菌的分離鑒定 使用預(yù)還原的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7)對糞便樣品進(jìn)行梯度稀釋。選取10-3～10-6的稀釋倍數(shù),吸取100 μL涂布于MRS平板。將MRS置于厭氧培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)48～72 h,觀察結(jié)果并記錄。依據(jù)菌落形態(tài)、伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊和乳酸菌細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法,采用生理生化實(shí)驗(yàn)初步對菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定,包括過氧化氫酶試驗(yàn)、糖類發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)等[14-15]。隨后,采用細(xì)菌組DNA提取試劑盒,按照說明書提取單一純化菌株的總基因組DNA。使用通用引物27F(5′-AGATTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)針對16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件如下:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃末端延伸7 min。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送至北京諾賽生物科技有限公司，進(jìn)行純化及雙向測序,測序后，結(jié)果使用Contig Express軟件進(jìn)行序列拼接。拼接后的序列在NCBI上的BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對,結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取相似度最高的菌種完成菌株鑒定。同時(shí)應(yīng)用MEGA 7.0對乳酸菌16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 糞便總基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增 采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取嬰兒腸道糞便樣品總DNA,具體步驟按照說明書進(jìn)行操作。使用1.2.2中提到的通用引物進(jìn)行16S rDNA全長擴(kuò)增,擴(kuò)增使用兩步法,第一步擴(kuò)增條件為:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,25個(gè)循環(huán);72 ℃末端延伸5 min。第二步擴(kuò)增條件為:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,25個(gè)循環(huán);72 ℃末端延伸5 min。擴(kuò)增后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小,并采用NanoDrop檢測其濃度和純度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 在QIIME中調(diào)用UCLUST序列比對工具,將測序序列生成相應(yīng)OTU。根據(jù)OTU注釋結(jié)果明確嬰兒糞便樣品中乳酸菌多樣性分布。通過分析不同樣品中OTU數(shù)據(jù),計(jì)算樣品的Alpha多樣性,包括Shannon、Chao1、Simpson、ACE指數(shù)等。其中Chao1與ACE指數(shù)主要體現(xiàn)群落的豐富度,而Shannon與Simpson指數(shù)主要側(cè)重群落的均勻度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及鑒定

2.1.1 乳酸菌的分離及初步鑒定 將收集到的8份不同來源的嬰兒腸道糞便樣品，經(jīng)由MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后,挑取形態(tài)不同的單一菌落進(jìn)行分離純化。根據(jù)生理生化試驗(yàn)結(jié)果和菌落形態(tài),初步確定從糞便樣品中共分離出32株乳酸菌,其中阿莫西林組2株,健康組30株,美羅培南組沒有分離到乳酸菌。

2.1.2 細(xì)菌總基因組DNA的提取及擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，對分離得到的32株初步鑒定為乳酸菌的菌株進(jìn)行DNA提取,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,DNA提取電泳結(jié)果條帶均正常且均一,因此挑選部分分離菌株的結(jié)果如圖1所示。分離菌株的DNA條帶在2000 bp以上且無雜帶,說明DNA的提取結(jié)果符合后續(xù)PCR擴(kuò)增要求。應(yīng)用PCR對16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果條帶正常且均一,因此挑選部分分離菌株的結(jié)果如圖2所示。通過與標(biāo)準(zhǔn)條帶比較,可觀察到條帶均在1500 bp左右,清晰單一且無引物二聚體,表明此PCR產(chǎn)物可用于后續(xù)基因測序。

圖1 部分分離菌株DNA提取電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of DNA extracted from part of isolated strains注:M為Marker DL2000;1～9為分離菌株基因組DNA。

圖2 部分分離菌株的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of PCR products form part of isolated strains注:M為Marker DL2000;1～10為分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物。

2.1.3 乳酸菌分子生物學(xué)鑒定 將提取的乳酸菌菌株DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，送至測序公司測序,采用NCBI上的BLAST數(shù)據(jù)庫對測序得到的拼接結(jié)果進(jìn)行序列同源性比對,獲取菌株鑒定結(jié)果(見表1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì),通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法共分離得到32株乳酸菌,其中L.rhamnosus12株(b1～b12)、E.faecalis6株(a1,a2,b13～b16)、L.gasseri4株(b17～b20)、L.plantarum3株(b21～b23)、L.casei3株(b24～b26)、P.pentosaceus3株(b27～b29)、B.longum1株(b30)。使用MEGA 7.0對分離得到的32株菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,揭示菌株的親緣關(guān)系(見圖3)。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,所有菌株均聚集在相應(yīng)參考菌株的分支上,證明鑒定結(jié)果正確,且不同樣品分離出的菌株具有一定的同源性。

表1 培養(yǎng)分離的乳酸菌16S rDNA序列BLAST比對結(jié)果Table 1 The BLAST comparison results of 16S rDNA sequences of isolated lactic acid bacteria

圖3 乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of lactic acid bacteria

2.2 單分子實(shí)時(shí)測序

2.2.1 糞便樣品物種豐度及多樣性 利用QIIME軟件，調(diào)用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列,剔除疑問序列后,對每個(gè)糞便樣品的測序量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),得到平均測序量為7863。隨后,使用QIIME調(diào)用UCLUST序列比對工具,基于97%的相似水平確定樣品中OTU數(shù)量(見圖4)。其中,每個(gè)橢圓代表一組糞便樣品,橢圓間的重疊區(qū)域表明組間的共有OTU,每個(gè)區(qū)塊的數(shù)字表明該區(qū)塊所包含的不同組別的共有或獨(dú)有OTU數(shù)量。基于不同分類等級(jí)的平均OTU數(shù)量,整體抗生素組中微生物豐度顯著小于健康組。Alpha多樣性指數(shù)包括Chao1、Simpson、Shannon以及ACE指數(shù),其中Chao1與ACE指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度,而Shannon和Simpson指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落均勻度。Alpha多樣性各項(xiàng)分析指數(shù)也表明,除A1外,整體抗生素組的多樣性指數(shù)低于健康組(見表2)。采用Mothur軟件,調(diào)用Metastats分析對各個(gè)分類單元進(jìn)行差異檢驗(yàn),兩組微生物多樣性在屬及種水平上均存在顯著性差異。對所有糞便樣品整體分組所得到的OTU進(jìn)行物種注釋,結(jié)果表明，屬、種水平為最佳分類水平,注釋過程中，將豐度≤1%的屬或種定義為Others(見圖5、圖6)。在屬水平上,健康組中主要以Streptococcus(19%)、Veillonella(18%)為優(yōu)勢屬;阿莫西林組以Enterococcus(65%)為優(yōu)勢屬;而美羅培南組主要以Escherichia(92%)為主導(dǎo)且菌屬單一。在種水平上,S.salivarius(18%)、V.parvula(15%)為健康組優(yōu)勢種;E.faecium(60%)為阿莫西林組優(yōu)勢種;E.fergusonii(91%)為美羅培南組優(yōu)勢種。以上物種分布情況說明，抗生素對腸道菌群穩(wěn)態(tài)具有一定程度的破壞性,且不同種類的抗生素影響具有差異性。

圖4 OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果Venn圖Fig.4 The OTU division and classification of status Venn diagram

圖5 屬水平微生物群落分布Fig.5 Distribution of gut microbiome at genus level注:乳酸菌及優(yōu)勢屬均以字母標(biāo)注:a:Escherichia, b:Enterococcus,c:Veillonella,d:Streptococcus, e:Lactobacillus,f:Pediococcus。

圖6 種水平微生物群落分布Fig.6 Distribution of gut microbiome at species level注:乳酸菌及優(yōu)勢種均以字母標(biāo)注:a-E:fergusonii,b-E:faecium, c-V:parvula DSM 2008,d-S:salivarius,e-L:rhamnosus GG,f-P:pentosaceus。

表2 Alpha多樣性指數(shù)Table 2 The index of Alpha diversity

2.2.2 乳酸菌種類及分布 根據(jù)三代測序結(jié)果所示(見表3),阿莫西林組中乳酸菌豐度極小且種類單一,主要為E.faecalis。美羅培南組沒有檢測到乳酸菌。健康組中乳酸菌多樣性較高,但普遍豐度較低(≤1%)且存在個(gè)體差異,其中L.rhamnosus為優(yōu)勢乳酸菌種,L.gasseri普遍存在于健康組腸道菌群中。該結(jié)果說明，抗生素的使用會(huì)減少嬰兒腸道菌群中乳酸菌的種類,且不同種類抗生素的影響存在差異性。

表3 基于高通量測序的糞便樣品中乳酸菌多樣性(以豐度計(jì),%)Table 3 Diversity of lactic acid bacteria in various fecal samples based on high-throughput sequencing(calculated by abundance,%)

3 結(jié)論

本文采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與基于PacBio Sequel平臺(tái)的SMRT測序技術(shù)相結(jié)合的方式,分離鑒定嬰兒腸道菌群中的乳酸菌菌株,并分析嬰兒腸道菌群乳酸菌多樣性及結(jié)構(gòu),同時(shí)探究抗生素使用對乳酸菌多樣性的影響。首先,通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法共分離得到32株乳酸菌,

經(jīng)鑒定分別為:L.rhamnosus、E.faecalis、L.gasseri、L.plantarum、L.casei、P.pentosaceus與B.longum;同時(shí),SMRT測序技術(shù)共獲得11種乳酸菌,分別為L.rhamnosus、E.faecalis、L.gasseri、L.casei、P.pentosaceus、L.paracasei、L.salivarius、L.paraplantarum、L.porcinae、B.pseudocatenulatum、B.longum。通過兩種分析方法結(jié)合的方式來看,相較于大多數(shù)西方國家的嬰兒腸道菌群，中國嬰兒腸道菌群含有較高豐度的乳酸菌,但乳酸菌多樣性呈現(xiàn)出較低的態(tài)勢,此結(jié)果與他人研究結(jié)果相吻合[16]。不同嬰兒腸道菌群中乳酸菌多樣性具有一定差異,但整體趨勢上抗生素使用會(huì)影響嬰兒腸道菌群乳酸菌多樣性,且不同種類抗生素影響程度不同。相較于健康組,抗生素組僅分離檢測到2種乳酸菌,分別為:E.faecalis以及L.porcinae。阿莫西林對嬰兒腸道乳酸菌影響程度小于美羅培南,但這兩種抗生素對嬰兒腸道乳酸菌均具有破壞性的影響。其次,傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可培養(yǎng)出三代測序技術(shù)中豐度較低或未檢測到的純化乳酸菌菌株,如L.plantarum、B.longum,但三代測序技術(shù)獲悉的乳酸菌多樣性更高。通過兩種方法結(jié)合,可更準(zhǔn)確地揭示嬰兒腸道菌群中乳酸菌的多樣性及分布。

總體而言,本文采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與三代測序結(jié)合的分析手段，研究嬰兒腸道菌群中乳酸菌多樣性,不僅提出了一個(gè)分析腸道菌群的新思路,而且證明抗生素確實(shí)可顯著降低嬰兒腸道菌群中乳酸菌的多樣性,為今后嬰兒腸道菌群研究提供了新的理論與技術(shù)支持。且通過分離得到的乳酸菌純化菌株,可為今后開發(fā)發(fā)酵乳酸菌制品提供新的菌種資源。