魏旭青,段長平,3,劉連利,徐姝穎,李秋瑩,孫 彤,*,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013; 2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 3.中核四〇四有限公司,甘肅蘭州 730000; 4.渤海大學實驗管理中心,遼寧錦州 121013)

在食品、印染及其它工業(yè)生產(chǎn)中,生物被膜會引起食品品質及生產(chǎn)設備損傷[1-3]。研究發(fā)現(xiàn),生物被膜可導致細菌病原體的持續(xù)生長及食品的交叉感染[4-5],其污染的產(chǎn)品會引發(fā)疾病,危害人體健康[6-8]。同時,生物被膜可粘附于食品、食品加工設備及食品貯藏容器的表面[9],造成食品腐敗、設備表面受損及運轉能耗增加[10-11]。由于生物被膜具有復雜的內(nèi)部環(huán)境,雖然表面的細菌易被抗生素殺死,但被膜細菌卻對抗生素不敏感,增加了抗生素的殺菌難度,從而降低其抗菌、殺菌作用[12-15]。因此,如何有效抑制材料表面生物被膜的形成及生長，成為當前研究的熱點之一。

目前應用較多的無機抗菌材料包括銀系抗菌材料[16-17]、TiO2光催化抗菌材料[18-19]、載銅抗菌材料[20]等。ZnO作為一種無機抗菌材料,具有活性高、穩(wěn)定性好的特點,同時具有良好的抑菌能力,已應用于多個行業(yè)[21]。制備ZnO的液相方法主要有直接沉淀法[22-23]、水熱合成法[24-25]、溶膠凝膠法[26-27]等。其中,水熱合成法因其工藝簡單、顆粒形態(tài)尺寸可控及易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化而被廣泛應用[28-29]。研究表明,納米ZnO對細菌生物被膜的形成和生長均具有抑制性能[28-30]。Shams等[29]發(fā)現(xiàn)，ZnO納米粒子可以抑制口腔致病菌的生物膜形成,其釋放出的Zn2+和產(chǎn)生的活性氧可以破壞細菌的細胞壁和細胞膜,從而達到殺菌的目的。同時,Rajendra等[30]發(fā)現(xiàn)ZnO納米粒子可以抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。

腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是冷藏海水魚類的優(yōu)勢腐敗菌,具有較強的致腐活性[31],能粘附于食品及容器表面，形成生物被膜[32],從而使食品腐敗加劇。因此,本實驗選用腐敗希瓦氏菌為抑菌對象。由于ZnO納米粒子的微觀形貌影響其抑制生物被膜的性能[33-35],本文為獲得具有不同微觀結構的ZnO薄膜,以陽極氧化法制備的多孔鈦片為基底,在真空輔助條件下,采用水熱合成法制備納米ZnO薄膜,研究水熱反應時間對ZnO薄膜微觀結構及其對腐敗希瓦氏菌生物被膜抑制性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐敗希瓦氏菌(ATCC8071) 美國微生物菌種保藏中心,實驗室保藏;LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂 以上合成培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術有限公司;實驗所用試劑 均為分析純(AR);0.2 mm厚的高純鈦箔(99.99%) 清河縣佳潤金屬材料有限公司;3 mm厚高純石墨片 天津亞達電機配件廠。

WU800型角磨機 寶時得機械(中國)有限公司;SK8210HP型超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司;MS605D型直流穩(wěn)壓電源 東莞市邁豪電子科技有限公司;DF-Ⅱ型集熱式磁力加熱攪拌器 江蘇省榮華儀器制造有限公司;LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;LRH型系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;PL602-L型電子天平 梅特勒-托利儀器有限公司;Rigaku Ultima IV型X射線粉末衍射儀 日本理學公司;S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司;OCA15EC型接觸角測量儀 北京東方德菲儀器有限公司;Victor X3型酶標儀 上海珀金埃爾默儀器有限公司。

1.2 多孔鈦片及其表面ZnO薄膜的制備和表征

1.2.1 陽極氧化法制備多孔鈦片 以鈦片為陽極,等面積石墨為陰極,在電極間距4.0 cm,電壓40.0 V條件下，于0.4%(V/V)氫氟酸(HF)電解液中，采用陽極氧化法處理鈦片60 min,分別用去離子水、乙醇清洗,120 ℃烘干 2 h,得孔徑約為50 nm的多孔鈦片[36]。

1.2.2 水熱合成法制備ZnO薄膜 將0.3 mol/L的Zn(CH3COO)2溶液和同濃度鹽酸羥胺溶液等體積混合后,加入0.1% wt的六偏磷酸鈉作為表面活性劑。在真空度為0.08 MPa條件下,將3 cm×1 cm多孔鈦片置于上述溶液中,浸漬20 min后轉入高壓反應釜中,填充率80%,150 ℃反應2、12和24 h,自然冷卻后取出,室溫陳化24 h,100 ℃干燥12 h,480 ℃煅燒2 h,得ZnO薄膜樣品[37]。

1.3 多孔鈦片及ZnO薄膜材料表征分析

采用X射線粉末衍射儀對樣品進行晶型分析(CuKα輻射,40 kV,50 mA,步寬0.02°,掃描速度4 °/min)。采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡，對樣品進行微觀形貌表征。運用切線法,采用接觸角測量儀，測定薄膜的水接觸角。

1.4 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜附著性能測定

活化后OD值約0.5的腐敗希瓦氏菌的菌懸液按1∶200稀釋,吸取稀釋好的菌懸液1 mL于無菌離心管中,放入基片,即帶有ZnO薄膜的多孔鈦片,28 ℃培養(yǎng)2、4、8、12、24、36和48 h后取出,測定其表面生物被膜的性能指標[38]。

1.4.1 鈦片及ZnO表面生物被膜粘附性能及被膜菌生長曲線測定 取出上述基片于無菌離心管中,1 mL 0.9%生理鹽水洗兩次以去除浮游菌,加入1 mL 1.0%結晶紫染色5 min,1 mL生理鹽水洗2次去除浮色,加入33%(V/V)冰乙酸0.2 mL脫色10 min,吸取脫色后溶液200 μL于96孔板中，用酶標儀測定OD595,表征生物被膜的粘附性能。

取上述基片,用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.4,KH2PO40.27 g,Na2HPO41.42 g,NaCl 8 g,KCl 0.2 g,加去離子水定容到1 L)沖洗3次,去除浮游菌,放入10 mL PBS中,于53 kHz、25 ℃條件下超聲處理10 min。梯度稀釋菌懸液,采用平板計數(shù)法測定生物被膜上腐敗希瓦氏菌的菌落數(shù)量,繪制其生長曲線。

1.4.2 生物被膜微觀形貌觀察 上述基片用無菌水沖洗3次,放入4 ℃預冷的2.5%(V/V)戊二醛中浸泡4 h,取出后分別在30%、50%、70%、90%(V/V)的乙醇中浸泡30 min,在無水乙醇中浸泡兩次,每次30 min,取出后于超凈臺內(nèi)自然風干。樣品噴金后,用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察其微觀形貌。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007處理實驗數(shù)據(jù),采用Origin8.0軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 多孔鈦片及ZnO薄膜的表征分析

2.1.1 ZnO薄膜的XRD表征分析 ZnO的晶型和結晶狀態(tài)影響ZnO薄膜的抗菌性。Shams等[39]發(fā)現(xiàn)納米粒子的形狀影響生物被膜的形成,Dutta等[40]發(fā)現(xiàn)不同的結晶狀態(tài)影響其抗菌性。與ZnO薄膜同時制備粉體的XRD表征結果表明,樣品為六方纖鋅礦結構ZnO晶體(JCPDS card No.36-1451),2θ角31.9°、34.5°、36.3°、47.6°、56.7°、62.9°和68.1°處的衍射峰分別對應于ZnO晶體的(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)和(112)晶面。由圖可見,衍射峰峰形尖銳,說明樣品結晶度好,無雜相峰,樣品純度高。

圖1 ZnO薄膜的XRD譜圖Fig.1 XRD patterns of the ZnO films

2.1.2 多孔鈦片及ZnO薄膜的SEM表征分析 由圖2可見,經(jīng)陽極氧化處理后,獲得孔徑約50～60 nm均勻排列TiO2孔洞的多孔鈦片(圖2(a)),水熱反應2 h得到的薄膜表面ZnO總量較小,且ZnO顆粒首先附著在TiO2多孔膜的孔道頂端及邊緣,并沿著骨架縱向堆積(圖2(b))。說明在水熱反應高溫高壓條件下,過飽和的鋅在多孔鈦片孔道頂端的TiO2晶體表面沉積,形成ZnO晶體。水熱反應12 h所得的薄膜表面上ZnO密集堆積,附著量明顯增大,在多孔鈦片表面形成一層密集的ZnO薄膜,但表面粗糙,ZnO無序堆積使薄膜分布不均勻(圖2(c))。水熱反應24 h所得薄膜表面ZnO有序堆積,附著量繼續(xù)增大,表面ZnO顆粒分布更加均勻(圖2(d))。說明隨著水熱反應時間延長,ZnO晶體繼續(xù)沉積,材料表面的孔道被ZnO晶體顆粒充滿。受孔道導向作用的影響,繼續(xù)生長的ZnO晶體沿固定方向有序生長,形成有序、均勻的多層結構。

圖2 多孔鈦片及不同水熱反應時間 制備的ZnO薄膜掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)多孔鈦片;(b)ZnO薄膜2 h;

2.1.3 多孔鈦片及ZnO薄膜表面親疏水性表征分析 根據(jù)檢測的接觸角的大小,可以將測試材料的親疏水性能分為以下三種:接觸角<90゜為親水性,90゜<接觸角<150゜為疏水性,接觸角>150゜為超疏水性[41]。由表1可見,多孔鈦片呈疏水性,ZnO薄膜均呈親水性,水熱反應時間越長,樣品的親水性越強。分析認為,由于納米管的存在,多孔鈦片與水接觸時,水滴無法與基底直接接觸,而與納米管及納米管中的空氣接觸,液滴與氣體接觸面積占比較大,故表現(xiàn)出較好的疏水性。由于納米ZnO粒徑小,且顆粒表面有毛細孔水和表面吸附水,其比表面積和表面能較大,使其親水性增強。隨著水熱時間延長,ZnO沉積量增大,薄膜表面能繼續(xù)增大,接觸角減小,材料表面親水性增強。

表1 多孔鈦片及不同水熱反應時間 制備的ZnO薄膜的水接觸角Table 1 The water contact angles of the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time

2.2 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜附著性能研究

2.2.1 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜粘附率及被膜菌生長曲線 由圖3可見,0～2 h,材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜粘附率和被膜菌總數(shù)上升很快,表明生物被膜從最初的可逆附著轉化為不可逆附著,生物被膜經(jīng)歷了生化作用階段和菌體附著階段,且菌體在生物被膜內(nèi)迅速繁殖。2～12 h,材料表面生物被膜粘附率及被膜菌菌落總數(shù)持續(xù)增長,即生物被膜進入生長階段。12～36 h,被膜粘附率及被膜菌菌落總數(shù)變化較小,說明生物被膜進入成熟期,基片表面附著的多糖和蛋白質為細菌提供營養(yǎng),使被膜菌數(shù)量持續(xù)增加。36 h后,材料表面生物被膜粘附率和被膜菌總數(shù)下降,生物被膜進入衰退期。

圖3 多孔鈦片及不同水熱反應時間制備的 ZnO薄膜表面生物被膜生長情況Fig.3 The growth states of the biofilms on the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)生物被膜粘附率;(b)被膜菌生長曲線。

由圖3(a)可見,ZnO薄膜表面生物被膜粘附率均低于同期多孔鈦片表面的被膜粘附率,且水熱反應時間越長,所制備的ZnO薄膜表面的被膜粘附率越低。由圖3(b)可見,材料表面被膜菌生長規(guī)律與生物被膜的粘附率呈正相關,即ZnO薄膜的抗生物被膜性能優(yōu)于多孔鈦片,且ZnO附著量越大,ZnO薄膜抗生物被膜性能越優(yōu)。分析認為,根據(jù)ZnO的離子溶出機理,ZnO薄膜上附著了生物被膜后,Zn2+溶出進入生物被膜中,與被膜菌的菌體蛋白酶結合,使之失去活性,從而使細菌死亡[42]。部分被膜菌死亡后,其分泌胞外多糖等被膜粘附物質的能力下降,因此ZnO薄膜的抗生物被膜性能優(yōu)于多孔鈦片。前期研究表明,材料表面疏水性提高有利于其抗生物被膜性能提高[33],但本研究中多孔鈦片的疏水性并未降低其表面生物被膜的粘附性能,包括被膜初始生長階段的粘附率。而被膜的初始粘附率及各時期粘附率均與ZnO的附著量呈正相關。說明ZnO薄膜對生物被膜中被膜菌的殺菌性能在抗生物被膜性能中的貢獻遠高于材料表面的疏水性。比較各ZnO薄膜,水熱反應時間越長,ZnO顆粒在材料表面的附著量越大,雖然其表面的多孔結構消失,且親水性更強,但其抗生物被膜性能更優(yōu),進一步說明ZnO薄膜的抗菌性決定了其抗生物被膜性能。由圖3(a)可見,ZnO薄膜上生物被膜的粘附率下降略早于多孔鈦片,這是由于被膜菌被殺死后，其分泌胞外多糖等粘附物質的能力下降所致。

2.2.2 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜微觀形貌分析 由圖4可見,在生物被膜培養(yǎng)2 h后,多孔鈦片及ZnO薄膜表面形成了粘附多糖及蛋白質膜,說明此階段生物被膜處于最初的粘附階段。12 h時,材料表面的胞外多糖膜增厚,多孔鈦片表面的生物被膜基本鋪滿,甚至有的將菌體包裹其中,此時生物被膜處于生長期。36 h時,可見粘附多糖形成的連續(xù)膜部分脫落,且部分細菌細胞受損,說明生物被膜經(jīng)歷生長期并開始進入衰退期。48 h后,生物被膜大部分脫落,且可見部分不完整菌體,此時為生物被膜的衰退期。比較同期各材料表面的生物被膜,多孔鈦片表面的生物被膜粘附物較多,ZnO薄膜表面的被膜粘附物和菌體數(shù)量較少,與材料表面生物被膜粘附率及被膜菌生長曲線的實驗結果一致。

圖4 多孔鈦片及不同水熱反應時間制備的ZnO薄膜表面生物被膜的掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of the biofilms on the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)多孔鈦片;(b)ZnO薄膜水熱2 h;(c)ZnO薄膜水熱12 h;(d)ZnO薄膜水熱24 h; 生物被膜培養(yǎng)不同階段:(1)2 h;(2)12 h;(3)36 h;(4)48 h。

3 結論

在水熱反應過程中,ZnO首先在多孔鈦片TiO2孔的孔道頂端及邊緣沉積,隨著水熱反應時間延長,TiO2孔道被ZnO晶體顆粒充滿,繼而形成有序、均勻的多層結構,且附著量明顯增大。多孔鈦片呈疏水性,ZnO薄膜呈親水性,且隨水熱時間的延長,其親水性增強。由于ZnO具有殺菌性能,ZnO薄膜對腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能增強,且水熱反應時間越長,其對腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能更優(yōu)。

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