于沛沛,王 斌,李婧茹,姜啟興,許艷順,劉曉麗,楊 方,夏文水

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG)作為葡萄糖的一種衍生物,在自然界中廣泛存在,尤其在甲殼類動(dòng)物的外骨骼中含量最高。它是合成雙歧因子的重要前體,在生物體內(nèi)具有許多重要生理功能,屬于功能性氨糖類化合物,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域,食品配料以及化妝品等[1-2]。

苯甲酸是我國(guó)常用的食品防腐劑之一,在酸性條件下,對(duì)細(xì)菌和真菌都具有較強(qiáng)的抑制作用。因苯甲酸需要以分子的形式發(fā)揮抑菌作用,中性條件下，苯甲酸的羧基會(huì)發(fā)生電離,從而使其失去抑菌活性。苯甲酸不僅在中性條件下抑菌效果差,還存在疊加中毒現(xiàn)象,在使用上有爭(zhēng)議,而且在一些國(guó)家的進(jìn)口食品中受到限制,應(yīng)用范圍越來(lái)越窄[3-4]。N-乙酰氨基葡萄糖上有大量的羥基,如果把其作為多元醇,和具有抑菌活性的苯甲酸發(fā)生酯化反應(yīng),理論上既可以降低苯甲酸的毒性,又因苯甲酸基團(tuán)的羧基生成酯鍵,在中性條件下不會(huì)發(fā)生電離,其抑菌效果可能受pH的影響不大。因此，開發(fā)苯甲酸酯化物對(duì)改善其中性條件下的抑菌效果，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文通過(guò)酯化反應(yīng)合成具有抑菌功能團(tuán)的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖衍生物,以期降低苯甲酸的毒性,擴(kuò)大抑菌譜,彌補(bǔ)苯甲酸只在酸性條件下才有抑菌性的不足,使其可以在更寬的pH范圍內(nèi)使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N-乙酰氨基葡萄糖 南通雙林生物制品有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 江南大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室;甲磺酸、苯甲酰氯、氨水、無(wú)水乙醚 分析純,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

SPX 型智能生化培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;ZK-82B型電熱真空干燥箱 上海試驗(yàn)儀器有限公司;5DDXB FT-IR型紅外光譜儀 美國(guó) Nicolet公司;DF-101SA-H型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 南京科爾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成及純化 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的N-乙酰氨基葡萄糖2.21 g于250 mL三頸燒瓶中,加入15 mL甲磺酸,0 ℃下以900 r/min速度攪拌30 min,至N-乙酰氨基葡萄糖完全溶解。加入4.8 mL苯甲酰氯,繼續(xù)攪拌3 h,反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物于-18 ℃下靜置2 h。將產(chǎn)物傾倒于500 mL冰水中,抽濾,得乳白色顆粒狀固體。將濾餅置于500 mL去離子水中,磁力攪拌至產(chǎn)物均勻分散于水中,用1 mol/L的氨水調(diào)pH至7.0。抽濾,將濾餅用乙醚洗滌,至乙醚洗液中檢測(cè)不出苯甲酸為止。抽濾,真空度90 KPa,溫度70 ℃下，真空干燥得乳白色粉末狀產(chǎn)物,即為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯。

1.2.2 反應(yīng)物配比對(duì)產(chǎn)物取代度的影響 在合成反應(yīng)中,保持反應(yīng)液溫度0 ℃,反應(yīng)時(shí)間3 h,將反應(yīng)物(苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖)摩爾比分別設(shè)為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1進(jìn)行試驗(yàn),通過(guò)高效液相分析,研究反應(yīng)物摩爾比對(duì)產(chǎn)物各酯含量的影響。

1.2.3 合成產(chǎn)物的紅外光譜分析 取反應(yīng)溫度0 ℃、時(shí)間3 h、反應(yīng)物摩爾比4∶1下制得的苯甲酸殼聚糖酯樣品100 μg,在4000～400 cm-1范圍內(nèi)記錄其紅外光譜圖。

1.2.4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液相圖譜分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品100 μg,進(jìn)行高效液相檢測(cè)。色譜柱為BEH C-18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),用0.2%的甲酸溶液和乙腈進(jìn)行梯度洗脫,洗脫條件為:0 min甲酸/乙腈(100∶0,v/v),15 min甲酸/乙腈(50∶50,v/v),20 min甲酸/乙腈(0∶100,v/v)。流速0.3 mL/min,柱溫30 ℃,采用WATERS ACQUITY PDA檢測(cè)器,在波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)樣量為5 μL[5-6]。

1.2.5 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的質(zhì)譜分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品100 μg,采用質(zhì)譜分析儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[6]。質(zhì)譜條件:離子方式ESI-,毛細(xì)管電壓3 kV,錐孔電壓30 V,離子源溫度100 ℃,脫溶劑氣溫度250 ℃,質(zhì)量范圍100～3000 m/z,光電倍增器電壓1600 V,氣體流速50 L/h。

1.2.6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的物理性質(zhì)測(cè)定

1.2.6.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯熔點(diǎn)的測(cè)定 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品1 mg,用毛細(xì)管法測(cè)定其熔點(diǎn)[7]。

1.2.6.2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯溶解性的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥至恒重的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品1.0 g于50 mL燒杯中,室溫下分別加入乙醇、乙醚、乙酸、丙酮、乙酸乙酯,攪拌使其充分溶解,過(guò)濾,沉淀經(jīng)真空干燥(干燥溫度30 ℃,干燥時(shí)間3 h,真空度90 KPa)后稱重,樣品在溶劑中的溶解度可由已溶解樣品的百分量來(lái)確定[8]。

1.2.7 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響因素

1.2.7.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯濃度對(duì)其抑菌作用的影響 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品溶解在乙酸乙酯溶液中,使其濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL,在pH6.5時(shí),用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其抑菌率[9]。

1.2.7.2 pH對(duì)苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯溶解在乙酸乙酯溶液中,濃度為1 mg/mL,分別在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5時(shí),用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其抑菌率[9]。

1.2.8 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對(duì)受試菌種抑菌直徑的測(cè)定 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品溶解在乙酸乙酯溶液中,濃度為1 mg/mL,分別在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5時(shí),用濾紙片抑菌圈法測(cè)定其抑菌效果,同時(shí)做苯甲酸和N-乙酰氨基葡萄糖的對(duì)照試驗(yàn)[10]。

1.2.9 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對(duì)受試菌種最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四種受試菌種,將不同濃度的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯樣品溶解在乙酸乙酯溶液中,在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5時(shí)測(cè)定其MIC,同時(shí)做苯甲酸和N-乙酰氨基葡萄糖的對(duì)照試驗(yàn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路線

將N-乙酰氨基葡萄糖與苯甲酰氯進(jìn)行酯化,甲磺酸在反應(yīng)中作催化劑,反應(yīng)取決于N-乙酰氨基葡萄糖羥基對(duì)苯甲酰氯的親核進(jìn)攻[12]。由于位阻效應(yīng),與亞甲基相連的羥基反應(yīng)活性更大,因此親核進(jìn)攻主要發(fā)生此位點(diǎn),但N-乙酰氨基葡萄糖是椅式結(jié)構(gòu),其它羥基的位阻效應(yīng)也不是很大,當(dāng)反應(yīng)物苯甲酰氯量小時(shí),與亞甲基相連的羥基會(huì)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng),而苯甲酰氯過(guò)量的情況下,每個(gè)羥基都有可能發(fā)生酯化反應(yīng),其合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路線Fig.1 The synthetic route of benzoyl NAG ester

2.2 反應(yīng)物配比對(duì)各酯含量的影響

從圖2中可以看出,隨著反應(yīng)物配比的增加,產(chǎn)物的酯化度升高,出現(xiàn)了單酯、二酯、三酯、四酯等不同的酯化產(chǎn)物。單酯的最佳反應(yīng)物配比為1∶1;二酯的最佳反應(yīng)物配比為2∶1;三酯的最佳反應(yīng)物配比為4∶1;四酯的最佳反應(yīng)物配比為5∶1。N-乙酰氨基葡萄糖雖為小分子物質(zhì),且由于其椅式結(jié)構(gòu),空間位阻效應(yīng)不大,但是要得到較高得率的四酯，仍然比較困難,從圖中也可以看出,反應(yīng)物配比從5∶1上升至10∶1時(shí),四酯的含量基本不變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),單酯、二酯在水和大多數(shù)有機(jī)溶劑中都具有很好的溶解性,洗脫提純時(shí)很容易損失掉,因此本文合成反應(yīng)的主要產(chǎn)物為三酯。

圖2 反應(yīng)物配比對(duì)各酯含量的影響Fig.2 The effect of reactant ratio on the content of each ester

2.3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的紅外圖譜

將純化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯進(jìn)行紅外光譜分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。圖中1725 cm-1和1267 cm-1出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰,分別歸屬于C=O的吸收和C-O-C伸縮振動(dòng),表明有酯鍵生成,1400～1600 cm-1之間的吸收峰為苯環(huán)的伸縮振動(dòng)所致,3400 cm-1處羥基的特征吸收峰幾乎消失,表明有大量的羥基參與酯化反應(yīng)[13]。

圖3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的紅外圖譜Fig.3 FTIR spectrum of benzoyl NAG ester

2.4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液質(zhì)聯(lián)用圖譜

本研究采用HPLC法對(duì)苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯進(jìn)行梯度洗脫,洗脫液由0 min 100%的甲酸溶液(0.2%)到20 min 100%的乙腈。圖4為純化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的HPLC圖譜,主峰保留時(shí)間為2.49 min,含量占89.95%,副峰保留時(shí)間為3.15 min,含量占6.35%。圖5為純化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的MS圖譜。負(fù)離子質(zhì)譜圖(ES-)中出現(xiàn)的534峰為[M+H],苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯的分子量533與質(zhì)譜信號(hào)相吻合,故可以認(rèn)為2.49 min出峰的物質(zhì)為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯;負(fù)離子質(zhì)譜圖(ES-)中出現(xiàn)的556峰為[M+Na],故可以認(rèn)為3.15 min出峰的物質(zhì)同為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯,為2.49 min出峰物質(zhì)的同分異構(gòu)體,兩種三酯的總含量約為97%。由此可見(jiàn),反應(yīng)溫度0 ℃,反應(yīng)時(shí)間3 h,反應(yīng)物(苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖)摩爾比4∶1時(shí)，合成的產(chǎn)物主要為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯。

圖4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液相圖譜Fig.4 The HPLC of benzoyl NAG ester

2.5 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的物理性質(zhì)分析

2.5.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔點(diǎn) 毛細(xì)管法測(cè)得N-乙酰氨基葡萄糖和苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔點(diǎn)。N-乙酰氨基葡萄糖的熔點(diǎn)為197～198 ℃,這與文獻(xiàn)值相符[14],苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔程范圍為171～175 ℃。苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔程變寬與樣品的純度有關(guān),而熔點(diǎn)的下降與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。因?yàn)轷セ磻?yīng)后,酰基的接入破壞了N-乙酰氨基葡萄糖的排列規(guī)整性,從而導(dǎo)致其熔點(diǎn)下降。

2.5.2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的溶解性 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯在不同有機(jī)溶劑中的溶解度見(jiàn)表1。從表1中可以看出,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯除在乙醚中基本不溶外,在其它溶劑中的溶解度相差不大。苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯在乙酸乙酯中有較好的溶解性,在我國(guó)乙酸乙酯已被批準(zhǔn)為食品添加劑[15],故可將產(chǎn)物先溶于乙酸乙酯,再添加至食品中。

表1 N-乙酰氨基葡萄糖、苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的溶解性(g/L)Table 1 Solubility of NAG and benzoyl NAG ester(g/L)

2.6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響因素

2.6.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯濃度對(duì)其抑菌作用的影響 抑菌劑濃度,即抑菌劑的添加量,是影響抑菌劑抑菌效果的一個(gè)重要因素。一般來(lái)說(shuō),添加量越高,其分子越多,與微生物接觸的幾率越大,抑菌效果就越好。但是當(dāng)抑菌劑與微生物之間達(dá)到平衡時(shí),再繼續(xù)添加就不能增強(qiáng)抑菌效果了。濃度對(duì)苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響見(jiàn)圖6。從圖中可以看出,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的抑菌活性隨濃度的升高逐漸增強(qiáng),低濃度處出現(xiàn)的異常結(jié)果,可能是由于濃度差別太小，抑菌效果分辨不明顯導(dǎo)致,并不能影響整體趨勢(shì)[16]。

圖6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯濃度對(duì)其抑菌作用的影響Fig.6 The influence of inhibitory concentration on bacteriostatic action of benzoyl NAG ester

2.6.2 pH對(duì)苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響 從圖7可以看出,隨pH由酸性到弱堿性的變化,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的抑菌效果變化不大。pH變化也是影響抑菌劑抑菌效果的一個(gè)重要因素,許多抑菌劑必須在特定pH下才有較好的抑菌性,從而導(dǎo)致使用受限,因此是否具有較寬的pH使用范圍已成為評(píng)價(jià)抑菌劑性能優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。由于苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯無(wú)自由氨基,主要靠苯甲酸基團(tuán)發(fā)揮抑菌作用,而苯甲酸基團(tuán)的羧基已生成酯鍵,在中性條件下不會(huì)發(fā)生電離,所以其抑菌效果基本不受pH影響。

圖7 pH對(duì)苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影響Fig.7 The influence of pH value on bacteriostatic action of benzoyl NAG ester

2.7 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對(duì)受試菌種的抑菌直徑及MIC

表2和表3為苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對(duì)四種受試菌種的抑菌效果,從抑菌直徑的比較中可以看出,N-乙酰氨基葡萄糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌無(wú)抑制作用,而且在某些pH條件下還會(huì)作為糖分被啤酒酵母、黑曲霉所利用,出現(xiàn)促進(jìn)生長(zhǎng)的現(xiàn)象[17];苯甲酸對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果相似,pH≤4.5條件下，苯甲酸有較好的抑菌效果,但pH>4.5條件下，其抑菌活性迅速減弱,至pH6.5時(shí)失去抑菌活性,這是因?yàn)楸郊姿嵝枰苑肿拥男问桨l(fā)揮抑菌作用,中性條件下苯甲酸的羧基會(huì)發(fā)生電離,從而使其失去抑菌活性[18];苯甲酸對(duì)啤酒酵母和黑曲霉表現(xiàn)出較好的抑菌效果,在pH3.5條件下，抑菌直徑可達(dá)18 mm和17 mm,但pH≥6.5條件下，同對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用效果相似,幾乎無(wú)抑菌性;合成產(chǎn)物苯甲酸乙酰氨基葡萄酯在所選pH范圍內(nèi)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑菌活性,在pH≥5.5條件下，抑菌效果優(yōu)于苯甲酸,測(cè)定MIC值得到的結(jié)論和以上基本一致。

表2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對(duì)受試菌種的抑菌直徑Table 2 The inhibition diameter of benzoyl NAG ester against strains

表3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯對(duì)受試菌種的MIC值Table 3 The MIC of benzoyl NAG ester against strains

綜上所述,與其母體N-乙酰氨基葡萄糖無(wú)抑菌性相比,合成產(chǎn)物苯甲酸乙酰氨基葡萄酯對(duì)受試菌種有良好的抑菌性;與苯甲酸相比,合成產(chǎn)物苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯亦彌補(bǔ)了苯甲酸只在酸性條件下具有抑菌性的不足,在酸性及中性條件下都有較好的抑菌效果。

3 結(jié)論

以N-乙酰氨基葡萄糖與苯甲酰氯為原料進(jìn)行酯化反應(yīng),在反應(yīng)溫度0 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h,苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖摩爾比為4∶1時(shí),經(jīng)提純得到合成產(chǎn)物主要為三酯。在pH3.5～7.5范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的最低抑菌濃度(MIC)范圍分別為2.4～2.6、1.4～1.6、2.0～2.2、1.8～2.0 g/L。與N-乙酰氨基葡萄糖相比,無(wú)論在酸性條件還是中性條件下,抑菌效果都明顯優(yōu)于N-乙酰氨基葡萄糖;與苯甲酸相比,在酸性條件下抑菌效果略低于苯甲酸,在中性條件下明顯優(yōu)于苯甲酸,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯亦彌補(bǔ)了苯甲酸只在酸性條件下具有抑菌性的不足,在酸性及中性條件下都有較好的抑菌效果,有望作為一種安全、高效防腐劑廣泛應(yīng)用于酸性及中性食品中。