張 晴,冷寒冰,徐美祿,周晏琳,于 笛,田元勇,劉俊榮,*

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023; 2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類。2016年,我國(guó)蛤類養(yǎng)殖總產(chǎn)量為417.3萬(wàn)噸,占海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量的29.4%[1]。菲律賓蛤仔的突出特點(diǎn)是產(chǎn)量大且抗脅迫能力強(qiáng),其活品及各種傳統(tǒng)或現(xiàn)代加工品深受消費(fèi)者喜愛(ài)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)菲律賓蛤仔的研究一直處于熱潮,研究方向一方面以產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖為主,包括繁殖、養(yǎng)殖和遺傳等[2-3];另一方面作為一種環(huán)境檢測(cè)物,探究菲律賓蛤仔對(duì)一些重金屬類(Hg、Pb等)環(huán)境污染物的富集作用[4-7];而從食品的角度出發(fā),菲律賓蛤仔的相關(guān)研究主要在其捕后品質(zhì)變化[8]、營(yíng)養(yǎng)分析及加工利用等方面[3]。

菲律賓蛤仔是一種軟體部分全部可食的貝類,傳統(tǒng)工藝和現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)中大多選用軟體部分來(lái)制作產(chǎn)品,而菲律賓蛤仔中被忽略掉的外套膜液部分也占有很高的含量,菲律賓蛤仔蒸煮液中,蛋白含量和總糖含量占到干物質(zhì)的80%以上[9]。因此,研究者逐漸把注意力轉(zhuǎn)移到對(duì)菲律賓蛤仔外套膜液的加工利用上。張龍等[10]對(duì)菲律賓蛤仔軟體各組織的一般化學(xué)組成和蛋白組成進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,而對(duì)于外套膜液的相關(guān)研究幾乎沒(méi)有。因此,本研究主要以菲律賓蛤仔外套膜液為原料,對(duì)外套膜液含氮物分布進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析,并對(duì)不同貯藏條件下外套膜液的主要組成物質(zhì)進(jìn)行分析,為提升菲律賓蛤仔經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活品菲律賓蛤仔 于2017年10月購(gòu)于遼寧省丹東市大鹿島;標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白 中國(guó)北京索萊寶科技有限公司;三氯乙酸、甲基紅、溴甲酚綠 上海麥克林生化科技有限公司;CuSO4、K2SO4分析純(AR),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;H2SO4、NaOH、HCl、硼酸、乙醚 分析純(AR),中國(guó)天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;苯酚 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;以上化學(xué)試劑 均為分析純。

高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)HERMLE Labortechnik GmbH公司;AE-6500垂直電泳槽 日本ATTO公司;UV-1800PC 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;101-1型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī) 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司;BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;IMS-40全自動(dòng)雪花制冰機(jī) 常熟市雪科公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理及貯藏 采捕上岸后低溫干藏6 h運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后,立即進(jìn)行分選剔除破損死亡個(gè)體后進(jìn)行貯藏處理。蛤仔樣本分為原料組和三個(gè)處理組,即原料組(Raw)、室溫濕藏組Wa(Ambient Wet Storage)、室溫干藏組Da(Ambient Dry Storage)及冷卻干藏組Dc(Chilled Dry Storage),具體貯藏方式如表1所示。原料組為分選后立即取樣;室溫濕藏組為分選后的蛤仔放置于鹽濃度為2.7 mg/L的海水中凈化48 h后,進(jìn)行取樣,期間于24 h時(shí)進(jìn)行一次換水;室溫干藏組和冷卻干藏組是將蛤仔放置于浸濕海水的毛巾上,同時(shí)蓋上一條同樣處理的毛巾,分別于室溫和4 ℃層析柜放置48 h后進(jìn)行取樣。本試驗(yàn)原料選取的是剛剛采捕上岸的菲律賓蛤仔,處于狀態(tài)較好的時(shí)期,劉慧慧等[8]對(duì)菲律賓蛤仔保藏的研究中發(fā)現(xiàn),濕藏暫養(yǎng)48 h后,蛤仔的存活率明顯下降,為了更貼近產(chǎn)品的加工利用,所以本實(shí)驗(yàn)選擇48 h貯藏期。

活品貯藏中的菲律賓蛤仔采樣后直接進(jìn)行處理,手工將殼、軟體組織以及外套膜液分離;外套膜液通過(guò)雙層紗布過(guò)濾收集,并分裝到50 mL離心管中,隨即置于-40 ℃保藏;全部軟體組織立即勻漿成肉糜,并在干冰速凍后于-40 ℃保藏。

1.2.2 一般化學(xué)組成測(cè)定 所用原料為各個(gè)處理組在-40 ℃保藏的蛤仔外套膜液及經(jīng)過(guò)干冰速凍后的軟體組織勻漿。以凈化后的樣品即室溫濕藏組為例,對(duì)菲律賓蛤仔的外套膜液及軟體勻漿進(jìn)行一般化學(xué)組成的測(cè)定。樣品經(jīng)4 ℃解凍后直接進(jìn)行一般化學(xué)組成的測(cè)定,采用國(guó)標(biāo)提供的方法測(cè)定水分(GB 5009.3-2016第一法 直接干燥法)、灰分(GB 5009.4-2016 第一法 食品中總灰分的測(cè)定)、粗蛋白質(zhì)(GB 5009.5-2-16 第一法 凱氏定氮法)、粗脂肪(GB 5009.6-2016第一法 索氏抽提法)和總糖(GB/T 9695.31-2008第一法 分光光度法),并進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用雙縮脲比色法[11]進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。雙縮脲標(biāo)準(zhǔn)曲線采用牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,將標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋至蛋白濃度為2、4、6、8、10 mg/mL,以稀釋蛋白∶雙縮脲為1∶4的比例混合均勻,同時(shí)進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),室溫放置30 min后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于540 nm下測(cè)吸光度值,可得出采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定,蛋白濃度的標(biāo)曲為y=0.0448x,R2=0.9998,可以較為精確地測(cè)定蛋白濃度。

將各個(gè)處理組在-40 ℃保藏的外套膜液樣品在4 ℃下解凍后均質(zhì)(10000 r/min,30 s)三次,采用雙縮脲法比色法,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.2.4 含氮物分離 采用熱水浸提法進(jìn)行分離。將各個(gè)處理組在-40 ℃保藏的外套膜液樣品在4 ℃下解凍后,于沸水浴中均勻加熱1 min,使蛋白質(zhì)受熱變性,冷卻后離心(12000×g,10 min),上清液為非蛋白態(tài)氮抽提物用于游離氨基酸分析,沉淀物則為蛋白態(tài)氮,用于氨基酸組成分析[12]。

1.2.5 游離氨基酸測(cè)定 將抽提物與10% TCA(三氯乙酸)按體積比1∶1混勻,離心(10000×g,10 min),用3% TCA稀釋樣品,吸取上清通過(guò)0.45 μm的(水系)針孔過(guò)濾膜,濾液采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行游離氨基酸的測(cè)定[13]。

1.2.6 氨基酸組成測(cè)定 采用酸水解法(GB 5009.124-2016)測(cè)定樣品中氨基酸含量。取0.5 g經(jīng)熱水浸提后的沉淀物于水解管中,加入10 mL濃度為6 mol/L的HCl、2滴苯酚,-20 ℃放置5 min,取出后吹入氮?dú)夥馄?于110 ℃放置24 h,冷卻后過(guò)濾,濾液定容至50 mL,蒸發(fā)除去鹽酸,用0.02 mol/L HCl稀釋樣品,通過(guò)0.45 μm的(水系)針孔過(guò)濾膜,濾液采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行游離氨基酸的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析,顯著性水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔外套膜液的一般化學(xué)組成特點(diǎn)

以室溫濕藏組為例,對(duì)菲律賓蛤仔的軟體組織和外套膜液的一般化學(xué)組成進(jìn)行了分析對(duì)比。結(jié)果如表2所示,軟體組織水分含量為81.14 g/100 g,外套膜液為95.70 g/100 g。從干物質(zhì)組分來(lái)看,軟體組織的主要成分為粗蛋白55.28 g/100 g,外套膜液主要成分則為灰分69.41 g/100 g,而軟體組織的灰分為13.65 g/100 g;外套膜液的粗蛋白雖然明顯低于軟體組織,但也高達(dá)15.82 g/100 g;此外,軟體組織的粗脂肪含量高于外套膜液,分別為6.07 g/100 g及3.19 g/100 g;值得關(guān)注的是,軟體組織與外套膜液的總糖含量差異不大,分別為15.84 g/100 g及15.11 g/100 g。外套膜液的高灰分含量主要有兩個(gè)原因,一是外套膜液中的無(wú)機(jī)鹽離子成分,另一方面,則由于殘留在外套膜液中的泥沙成分所致。

表2 菲律賓蛤仔軟體組織與外套膜液一般化學(xué)組成分析Table 2 Proximate compositions in soft body and mantle cavity fluid of Ruditapes philippinarum

分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn),菲律賓蛤仔外套膜液抽提氮含量達(dá)0.47 g/100 g,占外套膜液總氮含量即粗蛋白質(zhì)含量的近70%;相比之下,根據(jù)研究報(bào)道,菲律賓蛤仔的軟體組織的非蛋白氮含量則不到總含氮量的30%[10]。菲律賓蛤仔的外套膜液中含有豐富的以抽提氮為主的蛋白質(zhì)和碳水化合物,由此,進(jìn)一步對(duì)活品貯藏方法及貯藏過(guò)程中外套膜液含氮物和總糖含量進(jìn)行分析比較。

2.2 活品貯藏對(duì)外套膜液含氮物及總糖的影響

2.2.1 外套膜液抽提氮原料組及室溫濕藏組、室溫干藏組和冷卻干藏組的蛤仔外套膜液的抽提氮變化分布 如圖1所示。從圖1中可以看出,原料蛤仔的外套膜液抽提氮含量顯著低于貯藏組(p<0.05),在經(jīng)過(guò)貯藏之后含氮量均有所升高;冷卻干藏組含氮量顯著高于室溫下的濕藏及干藏(p<0.05)。

圖1 活品貯藏48 h后的外套膜液抽提氮含量(濕基)Fig.1 Contents of extractive nitrogenin mantle cavity fluid after 48 h live storage(wet basis)注：不同字母表示組別間差異顯著(n=3，p<0.05)。圖2、圖3同。

此外,雙縮脲蛋白含量分析結(jié)果呈現(xiàn)相同趨勢(shì)(圖2)。原料組蛋白含量最低,外套膜液中僅為4.87 mg/mL,在經(jīng)過(guò)貯藏之后蛋白濃度均顯著增高(p<0.05),其中變化最為明顯的是冷卻干藏組,濃度高達(dá)11.37 mg/mL,幾乎為原料組的三倍,室溫濕藏組和室溫干藏組相比原料組也有所升高,蛋白濃度分別為6.81和8.69 mg/mL。總體來(lái)看,在不同的貯藏條件下,原料組蛋白質(zhì)含量顯著低于貯藏組(p<0.05),且冷卻組的蛋白質(zhì)含量顯著高于室溫下的干藏組和濕藏組(p<0.05)。雙縮脲法測(cè)蛋白濃度具有一定的局限性,因此,雙縮脲法對(duì)外套膜液進(jìn)行的蛋白含量測(cè)定只能粗略的顯示出蛋白含量變化的趨勢(shì),而不用于具體分析。

圖2 活品貯藏48 h后的外套膜液蛋白含量(濕基)Fig.2 Contents of protein in mantle cavity fluid after 48 h live storage(wet basis)

2.2.2 外套膜液總糖分布 原料組及室溫濕藏組、室溫干藏組和冷卻干藏組的外套膜液總糖含量分析結(jié)果如圖3所示?？傮w上來(lái)看,原料組的總糖含量最低,但與室溫濕藏組相比,并未出現(xiàn)顯著差異(p>0.05);在經(jīng)過(guò)干藏處理之后,總糖含量均顯著升高(p<0.05),而冷卻干藏處理的總糖含量顯著高于室溫干藏處理(p<0.05)。外套膜液的總糖含量與抽提氮及蛋白態(tài)氮的含量測(cè)試結(jié)果顯示出相似的趨勢(shì)。

與原料組相比,各處理組的外套膜液抽提氮、蛋白質(zhì)以及總糖的含量(圖1～圖3)均有所升高,

圖3 活品貯藏48 h后的外套膜液總糖含量(濕基)Fig.3 Contents of carbohydrates in mantle cavity fluid after 48 h live storage(wet basis)

分析原因,可能是為活品狀態(tài)的蛤仔外套膜液的含量因蛤仔生命代謝發(fā)生了變化,即外套膜液水分降低,導(dǎo)致化學(xué)組成成分的不同程度濃縮。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),干藏處置下的各個(gè)組分高于濕藏處置,冷卻條件高于常溫條件,由此來(lái)看,冷卻干藏更促進(jìn)外套膜液水分流失。

2.3 活品貯藏對(duì)外套膜液氨基酸組成的影響

2.3.1 外套膜液抽提氮的游離氨基酸分布 表3為菲律賓蛤仔外套膜液抽提氮的游離氨基酸分析結(jié)果。原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組以及冷卻干藏組游離氨基酸總量依次為58.25、77.48、83.47、134.14 mg/100 mL。各組間均存在差異,其中冷卻干藏組含量最高,其次為室溫干藏組和室溫濕藏組,原料組最低。

表3 外套膜液抽提氮游離氨基酸含量(mg/100 mL抽提物)Table 3 Contents of free amino acids in mantle cavity fluid extracts(mg/100 mL extracts)

在貽貝的蒸煮液研究中發(fā)現(xiàn)其呈味物質(zhì)豐富[14],在蛤仔中氨基酸有效呈味物質(zhì)為甘氨酸、L-谷氨酸和L-精氨酸,甘氨酸呈現(xiàn)甜味,谷氨酸可以提供鮮味,精氨酸被認(rèn)為是多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物的呈味成分,可以提高風(fēng)味[15]。在表3中可以發(fā)現(xiàn),這三種氨基酸在外套膜液中的含量很高,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組及冷卻干藏組甘氨酸含量分別為19.73、20.60、25.60、40.11 mg/100 mL,谷氨酸含量為7.62、9.36、11.29、17.01 mg/100 mL,精氨酸含量為8.06、10.85、11.58、20.20 mg/100 mL,在不同貯藏條件下,三種氨基酸總含量均占到總游離氨基酸的50%以上。除了這三種氨基酸外,丙氨酸的含量也相對(duì)較高,分別為7.86、11.30、12.25、17.08 mg/100 mL,丙氨酸也是一種常見(jiàn)的能使人感到甜味的氨基酸,因此,菲律賓蛤仔的外套膜液在開(kāi)發(fā)海鮮調(diào)味料方面極具開(kāi)發(fā)潛力[16]。

此外,除了分析方法所限(色氨酸),其它7種必需氨基酸包括蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及賴氨酸均有檢測(cè),其中賴氨酸含量最高,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組及冷卻干藏組賴氨酸含量分別為3.40、6.83、5.85、11.99 mg/100 mL。從表3可知,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組和冷卻干藏組必需氨基酸占總游離氨基酸的比值,在不同活品狀態(tài)的蛤仔之間存在一定差異,換言之,貯藏方式和條件對(duì)外套膜液的化學(xué)組成特性有一定影響。此外,游離氨基酸分析表明,菲律賓蛤仔外套膜液不僅具有調(diào)鮮功能,而且還可以提供人體所需的必需氨基酸,尤其是賴氨酸。

2.3.2 外套膜液蛋白氮的氨基酸組成 表4為菲律賓蛤仔外套膜液蛋白態(tài)氮的氨基酸組成分析結(jié)果。由表4可知,室溫濕藏組及冷卻干藏組整體無(wú)顯著差異(p>0.05),且這兩個(gè)處理組均顯著高于原料組及室溫干藏組(p<0.05);各組必需氨基酸含量占總氨基酸的百分比結(jié)果表明,原料組、室溫濕藏組、室溫干藏組以及冷卻干藏組比值為25.54%、37.46%、27.13%、28.84%。對(duì)原料組及不同貯藏組必需氨基酸含量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)室溫濕藏組的必需氨基酸含量占總氨基酸的比值達(dá)到37.46%,而其他三組均未達(dá)到30%以上。室溫濕藏組高于其它組的原因,與活品生命代謝關(guān)系不大,可能是由于生物樣本自身的個(gè)體差異所致。

表4 外套膜液蛋白態(tài)氮氨基酸組成(g/100 g沉淀物)Table 4 Composition of amino acids in protein nitrogen of mantle cavity fluid(g/100 g precipitate)

3 結(jié)論

菲律賓蛤仔外套膜液中水分含量高達(dá)95.70 g/100 g;干物質(zhì)中主要由灰分、粗蛋白及總糖組成,含量分別為69.41、15.82及15.11 g/100 g;含氮物中70%左右為非蛋白態(tài)即抽提氮。與原料組相比,三個(gè)貯藏組的總氮、抽提氮、游離氨基酸和總糖有明顯升高趨勢(shì),生命代謝及水分流失是產(chǎn)生波動(dòng)的主要原因,且冷卻干藏組受到的影響最顯著(p<0.05)。各個(gè)處理組氨基酸含量雖然存在明顯差異,其中有效呈味氨基酸(甘氨酸、谷氨酸和精氨酸)占總游離氨基酸的50%以上,呈甜味的氨基酸丙氨酸含量也較高;蛋白態(tài)氮和抽提氮中均檢測(cè)到了人體所需要的必需氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及賴氨酸),而且在蛋白態(tài)氮中含量較高,其中賴氨酸含量最高。菲律賓蛤仔外套膜液的美味和營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì),為開(kāi)發(fā)高附加值鮮味劑提供參考。本文僅對(duì)菲律賓蛤仔氨基酸呈味物質(zhì)進(jìn)行了分析,其他呈味物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、多肽、核酸、有機(jī)堿和糖等還有待進(jìn)一步研究。