蒲洋，丁涓，彭煒航，孫靜，王艷華

(1.魯東大學 農學院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學 生命科學學院，山東 煙臺 264025； 3.山東博華高效生態(tài)農業(yè)科技有限公司，山東 濱州 256500)

自從紫球藻(Porphyridiumcruentum)這一原始單細胞紅藻被從海水中分離培養(yǎng)之后，很多研究聚焦于開發(fā)利用其合成的大量高價值生物活性物質[1～4]。紫球藻中的藻膽蛋白、多不飽和脂肪酸和多糖等生物活性物質在醫(yī)藥、化妝品、材料等高端產業(yè)中有廣闊的應用前景及潛在價值，但是高密度培養(yǎng)與采收技術限制了紫球藻價值的進一步開發(fā)利用[2]。借助基因工程和細胞工程技術改良藻種，或許是去除這個制約的有效手段。2013年公開了與紫球藻親緣關系非常近的淡色紫球藻(Porphyridiumpurpureum)的全基因組序列，測得基因組大小為19.7 Mbp，共有8 355個預測基因，2016年報道了利用AFM對紫球藻光合系統(tǒng)的藻膽體-類囊體膜的超分子結構進行了卓有成效的研究，這一系列的理論研究有助于推進紫球藻生理及遺傳育種研究[5,6]。

缺乏細胞壁和多糖外殼的原生質體是植物生理學、細胞學研究與遺傳育種的良好材料，更是通過細胞融合和基因操作手段培育新品種的重要工具[7]。國內外學者對紫球藻原生質體酶解制備進行了相關研究，用纖維素酶和果膠酶組成的混合水解酶液，經單因素試驗通過28 ℃水解4 h得到56.4%的原生質體制備率，并探討了機械剪切力，以及細胞壁多糖組成對原生質體制備率的影響[8～10]；但是對多個因素如何共同影響紫球藻原生質體制備的相關研究未見報道。應用Box-Behnken設計的響應面法(RSM)，能夠研究多個參數的組合效應[11，12]。本文針對紫球藻細胞壁的結構和成分，在EDTA和DTT混合溶液對藻細胞進行預處理的基礎上，用含纖維素酶和果膠酶的混合酶液制備原生質體。考察酶液濃度、兩種酶的比例和pH 3個參數，進一步優(yōu)化紫球藻原生質體制備條件，提高紫球藻原生質體的制備率，用于滿足后續(xù)基因工程和遺傳育種研究的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫球藻(Porphyridiumcruentum)藻種由中科院海岸帶研究所提供，經煙臺大學海洋學院分離純化和篩選的純種，F/2海水培養(yǎng)基培養(yǎng)。預處理劑：50 mmol·L-1EDTA、25 mmol·L-1DTT，滲透壓穩(wěn)定劑：0.2 mol·L-1KCl溶液，酶：纖維素酶(Cellulose R-10，Yakult Honsha)、果膠酶(Macerozyme R-10，Yakult Honsha)，緩沖液：0.1 mol·L-1不同pH的磷酸鉀緩沖液，除兩種酶以外其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

ZD-88臺式恒溫震蕩培養(yǎng)搖床，金壇市城西天竟實驗儀器廠；BXM-30立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；5430R高速冷凍離心機， Eppendorf公司；CX21光學顯微鏡，奧林巴斯；超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 混合酶液的配制與保存

將纖維素酶、果膠酶按照不同的量在0.2 mol·L-1KCl溶液中配制成不同濃度的混合酶解液，震蕩使其混合均勻，并用一次性注射器過濾，放在冰箱中冷藏備用。

1.3.2 細胞收集和預處理

取對數期紫球藻藻液5 mL于離心管中，離心除去上清，用無菌水充分洗滌，重復2次。將藻細胞重新懸浮于50 mmol·L-1EDTA和25 mmol·L-1DTT的混合溶液中，在30 ℃下，輕微震蕩。

1.3.3 分離純化原生質體

將預處理后的藻細胞離心并去除上清，加入無菌水洗滌2次后，用混合酶液和不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的緩沖液懸浮，輕微震蕩使細胞壁酶解，每30 min在顯微鏡下觀察酶解情況，酶解6 h后終止反應。離心收集細胞和原生質體，去除上層破碎的細胞壁、雜質及酶液，用高滲溶液洗滌。

1.3.4 原生質體制備率的計算

原生質體的數量等于懸浮于高滲溶液的細胞數量與懸浮于無菌水破裂的剩余細胞數量之差。因此得出原生質體制備率的公式：原生質體制備率=(高滲溶液中的細胞數目-無菌水中的細胞數目)/高滲溶液中的細胞數目×100%[12]。

1.3.5 混合酶濃度、酶比例和pH的選擇

將纖維素酶、果膠酶以1∶1的比例按照體積分數分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的量在0.2 mol·L-1KCl溶液中配制成不同濃度的混合酶解液，震蕩使其混合均勻，加入到預處理后的藻細胞中，調節(jié)pH為7，酶解6 h終止反應，測定原生質體制備率。

將體積分數2%的纖維素酶和果膠酶按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例在0.2 mol·L-1KCl溶液配制成不同濃度的混合酶解液，震蕩使其混合均勻，加入到預處理后的藻細胞中，調節(jié)pH為7，酶解6 h后終止反應，測定原生質體制備率。

將纖維素酶、果膠酶以1∶1的比例按照2%的體積分數在0.2 mol·L-1KCl溶液中配制成不同濃度的混合酶解液，震蕩使其混合均勻，加入到預處理后的藻細胞中，調節(jié)pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，酶解6 h后終止反應，測定原生質體制備率。

1.3.6 響應面試驗設計

采用Box-Behnken中心組合設計以X1(酶濃度)、X2(酶比例，纖維素酶：果膠酶)、X3(pH)為自變量，以Y(原生質體制備率%)為響應值的三因素三水平試驗，中心組合試驗方案中的因素及水平如表1所示。數據用 Design-Expert 8.0進行分析。分別選擇各個因素中包含最高制備率的3個水平，即酶比例為2∶1、1∶1和1∶2，酶濃度為1.5%、2%和2.5%，pH為6.5、7.0和7.5，設計了三因素三水平的響應面試驗，中心試驗重復5次，共進行了17個試驗，試驗因素水平如表1。

表1響應面實驗因素與水平

Table1 Factors and levels used in response surface experiments

變量Variables酶濃度/%Enzyme concentration酶比例Proportion of enzymepHpH-11.5 2∶16.502 1∶17.012.5 1∶27.5

2 結果與分析

2.1 不同酶解時間下的紫球藻

在酶解液中，細胞壁逐漸破碎，暴露出紫球藻的原生質體。如圖1(b)，明顯可見破碎的細胞壁。由于失去了細胞壁，色素外滲，原生質體的顏色較正常的紫球藻細胞較淺。圖1(a)和圖1(c)分別為紫球藻細胞及其原生質體。

2.2 不同酶濃度、酶比例和pH對原生質體制備率的影響

如圖2(a)所示，當混合酶濃度比較低時，隨著酶濃度的增加原生質體的制備率也得到增加。酶濃度達到2%時，原生質體的制備率隨著混合酶濃度的增加而下降?？赡艿脑蚴窃谔囟舛鹊脑逡簵l件下，混合酶濃度較低時酶解反應不夠充分,不能夠將足量的藻細胞制備成原生質體；在較低混合酶濃度范圍內原生質體制備率與酶濃度呈正相關。隨著酶濃度的增加，一旦超出合適的范圍過量的混合酶可能使已經制備出的原生質體發(fā)生破裂導致原生質體制備率降低[9]。因此，混合酶濃度在2.0%左右較為合適。

圖2 紫球藻在不同酶濃度(a)不同酶的比例(b)和不同pH(c)條件下的原生質體制備率Fig.2 The protoplast formation rate of Porphyridium cruentum with different enzyme concentrations (a)different enzyme ratio (b) and different pH(c)

如圖2(b)所示，當纖維素酶與果膠酶體積比降低時，隨著果膠酶體積比的增加，原生質體的制備率也得到增加。纖維素酶與果膠酶體積比為1∶2時，原生質體的制備率最高，隨著果膠酶體積比的增加而下降。這可能與特定培養(yǎng)條件下，紫球藻細胞壁多糖的復雜組成相關。結果表明本試驗選用纖維素酶和果膠酶1∶2左右較為合適。

如圖2(c)所示，隨著pH值的增加，原生質體的制備率不斷增加。pH達到7時，原生質體的制備率最高，隨著pH值的進一步增加原生質體的制備率反而下降。這可能是因為pH 7左右是2種酶的最適pH，過高過低都會影響兩種酶的活性，因此pH 7左右為宜。

2.3 響應面試驗結果分析

利用Design-Expert 8.0軟件的Box-Behnken設計，以酶濃度、不同酶的比例、pH值為變量，原生質體制備率(%)為響應值，進行響應面試驗，結果如表2所示。對表2試驗數據進行多元二次回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y=55.10+5.19X1-0.075 X2+1.76X3-0.85X1X2-3.13X1X3-4.20X2X3-9.09X12-6.66X22-7.49X32

表2三因素獨立變量的Box-Behnken試驗設計

Table2 Box-Behnken experimental design with three independent variables

Run No.X1 X2 X3Y1(-1)(-1)(0)32.32(-1)(1)(0)31.23(1)(-1)(0)49.24(1)(1)(0)44.75(0)(-1)(-1)33.26(0)(-1)(1)46.27(0)(1)(-1)44.18(0)(1)(1)40.39(-1)(0)(-1)31.410(1)(0)(-1)43.211(1)(0)(1)39.412(-1)(0)(1)40.113(0)(0)(0)54.614(0)(0)(0)52.715(0)(0)(0)58.616(0)(0)(0)53.217(0)(0)(0)56.4

由表3可知，二次回歸模型的F值為9.57，P值為0.003 42，表明模型達到了顯著水平，失擬項P=0.125 8>0.05，說明失擬項差異不顯著，試驗無失擬因素存在，能充分反映試驗真實情況，回歸模型合理；試驗模型的決定系數R2=0.933 4，說明原生質體制備率的結果與模型預測結果有較好的一致性，試驗模型的校正系數R2Adj=0.847 8，試驗結果有84.78%受試驗因素的影響。因此，結果可靠，此模型可以對原生質體結果進行分析和預測。

回歸方程各項方差分析中F檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此得到各因素對原生質體制備率影響的主次順序為X1>X3>X2，即2種酶濃度對原生質體制備率的影響最大，其次是pH值，最后是兩種酶的比例。

表3回歸模型的方差分析

Table3 Analysis of variance(ANOVA)for the regression equation

方差來源Soruce of variation平方和Sum of squares自由度Degrees of freedem均方Mean squareF值F-valueP值Probe>F模型Significant1 211.889134.6510.900.002 4X1215.281215.2817.430.004 2X20.045 10.045 3.643 0.953 6X324.85124.852.010.199 0X1X22.8912.890.230.643 4X1X339.06139.063.060.118 6X2X370.56170.565.710.048 2X12347.721347.7228.150.001 1X22186.901186.9015.130.006 0X32236.051236.0519.110.003 3殘差86.46712.35失擬差62.92320.973.560.125 8凈誤差23.5645.89總離差1 298.3616R2=0.933 4R2Adj=0.847 8

2.4 三維響應面分析

通過Box-Behnken試驗得到的多元二次回歸模型所作的響應面圖，在其他試驗因素固定不變的情況下，考察交互項對得率的影響，響應面分析圖可用于評價試驗因素對原生質體得率影響的兩兩交互作用[11,12]。各因素交互作用對響應值的影響如圖3所示。

圖3 通過表2得到最優(yōu)Y值的三維響應面圖Fig.3 Three dimensional contour plots for the maximum Y. RSM plots were generated using the data shown in Table 2

由響應曲面圖3可知，隨著酶濃度的增大，原生質體制備率含量也隨之增加，但是當酶濃度增加到一定比例后，原生質體制備率不再增加反而下降。由響應曲面的陡峭程度可知，酶濃度影響非常顯著，其次是pH，酶比例的變化對原生質體制備率的影響不明顯。隨著濃度和酶比變化的響應面趨勢呈拋物線，出現極大值，并且曲面坡度較陡，說明兩者之間存在交互作用，而曲面平緩，等高線稀疏，pH邊幾乎保持直線，說明pH與酶比例和pH與酶濃度之間交互作用不明顯。

根據此二次回歸模型，推測紫球藻原生質體的最佳制備條件理論值為：選2.17%酶濃度，纖維素酶與果膠酶比例為2∶3的混合液，滲透壓穩(wěn)定劑為0.2 mol·L-1KCl，在pH 7.2，30 ℃下輕微振蕩，酶解6 h后計數所得的理論原生質體制備率為67.3%。將該條件微調為酶濃度2.2%、纖維素酶與果膠酶體積比2∶3，pH為7，進行實驗驗證，所得制備率為68.5%，相對誤差為2%，與預測值相吻合。

3 討論與結論

藻類原生質體制備的本質就是水解復雜的細胞壁多糖，另外紫球藻在生長過程中還分泌大量紫球藻多糖，在細胞外形成一層成分和結構復雜的黏質膜鞘；并且不同的培養(yǎng)條件對胞外多糖的種類和產量有較大影響，這就增加了其原生質體制備的難度和特殊性[10,13]。因此參考之前的報道用50 mmol·L-1EDTA、20 mmol·L-1DTT混合液進行預處理，變性其外壁層中的蛋白鞘，利用0.2 mol·L-1KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑[9]；在30 ℃下，通過輕微震蕩使藻細胞和酶液混合均勻并充分接觸，提供適當的機械剪切力促進原生質體釋放[14]；用Box-Behnken試驗設計能夠提供良好的精度和系統(tǒng)建模方法，通過盡可能少的實驗確定了理論上靠近中心最優(yōu)點的混合酶濃度、纖維素酶與果膠酶體積比例和pH值[15]。在這些最佳參數下，獲得了最大為68.5%的制備率，為紫球藻生理生化研究，基因工程和遺傳育種提供了良好的材料，紫球藻細胞壁及胞外多糖的具體組成及影響原生質體制備的詳細機理有待于更加深入研究。