馬浩天，張宏江，杭偉，崔紅利，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

近年來，我國的規(guī)模化、集約化畜牧養(yǎng)殖業(yè)得到了較大的發(fā)展，為第一產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了強(qiáng)勁的推動(dòng)力。但是，該模式下，富含氮磷、抗生素以及重金屬等污染物質(zhì)的畜禽糞便大量排入環(huán)境，造成了嚴(yán)重的環(huán)境生態(tài)污染[1]?，F(xiàn)今，傳統(tǒng)的畜禽廢水處理方法存在效率低、成本高和資源化利用增值小等問題。而在實(shí)際生產(chǎn)中，大部分的畜禽廢水都未經(jīng)處理，直接排放或者還田，廢水中的污染物質(zhì)遷移入土壤，這些污染物殘留在土壤中，也會(huì)對(duì)植物生長發(fā)育及品質(zhì)造成毒害[2]。另一方面，畜禽廢水的直接排放也造成了資源的浪費(fèi)。

微藻是一類廣泛存在于各類水環(huán)境中的單細(xì)胞微生物，吸收利用N、P能力強(qiáng)。利用微藻凈化廢水的技術(shù)早已引起關(guān)注。畜禽廢水中大量的氮磷等物質(zhì)，能夠滿足微藻對(duì)氮源和碳源的需求。廢水中的重金屬、抗生素等污染物也會(huì)被微藻富集和降解[3]。楊坤等[4]通過柵藻(Scenedesmusobliquus)和小球藻(Chlorellavulgaris)對(duì)4種養(yǎng)殖廢水的凈化效果的研究，發(fā)現(xiàn)2種微藻對(duì)總磷的去除率在 89.32%～98.69%，對(duì)硝態(tài)氮的去除率也在 60% 以上。Dahmani 等[5]發(fā)現(xiàn)小球藻C.pyrenoidosa可去除廢水中95%的總氮和81%的總磷。利用畜禽廢水培養(yǎng)微藻，還能獲得大量的微藻生物質(zhì)以用于下游產(chǎn)品如生物柴油、功能性飼料等高值產(chǎn)品開發(fā)[6]，進(jìn)而形成基于微藻廢水處理聯(lián)產(chǎn)高值生物化工產(chǎn)品的新型綠色產(chǎn)業(yè)鏈。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，微藻在高效去污的同時(shí)可以獲得較高產(chǎn)量的油脂，例如Li 等[7]發(fā)現(xiàn)柵藻Scenedesmussp. LX1不僅可以去除83%～89%的氮和99%的磷，而且藻細(xì)胞富集油脂高達(dá)生物量的30%～53%。在大多數(shù)情況下，畜禽廢水中高含量的氮為微藻的生長提供了富余的氮元素，但高N也影響微藻油脂的積累，限氮的環(huán)境卻有利于微藻細(xì)胞積累大量油脂[8]。因此，如何兼顧污水治理效果與微藻油脂的高產(chǎn)率是值得深入研究的問題。

本研究對(duì)山西省太谷縣當(dāng)?shù)匾火B(yǎng)雞場廢水中的N、P等污染物進(jìn)行了檢測，并選用本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的一株能源綠藻即埃氏小球藻(C.emersonii)為試材，分析了該微藻在不同濃度雞場廢水中的生長情況，對(duì)不同濃度廢水中氮、磷的去除效果，以及微藻細(xì)胞油脂合成積累特征。研究表明，埃氏小球藻可在四倍稀釋以上的雞場廢水中較快生長，能有效脫氮除磷，且藻細(xì)胞油脂合成積累增高。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 微藻藻種

本試驗(yàn)所用藻種為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所分離保存的埃氏小球藻。

1.1.2 雞場廢水與BG-11培養(yǎng)基

雞場廢水采自山西省太谷縣某養(yǎng)雞場，為沖圈廢水，于0.45 μm濾膜抽濾后經(jīng)高壓滅菌備用。將滅菌備用的廢水原液進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋后直接用作微藻培養(yǎng)基。對(duì)照培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基(表1)，調(diào)節(jié)pH至7.6。

表1 BG-11培養(yǎng)基的成分Table 1 The composition of BG-11 medium

1.2 方法

1.2.1 雞場廢水污染物組分的檢測

雞場廢水中總氮(Total nitrogen, TN)和總磷(Total phosphorus, TP)均按照國標(biāo)HJ636-2012和GB 11893-8的規(guī)定，分別采用過硫酸鉀消解—紫外分光法和鉬酸銨分光光度法測定。化學(xué)需氧量(Chemical oxygen demand, COD)采用重鉻酸鉀氧化法測定。雞場廢水原液中的金屬元素經(jīng)濃HNO3—H2O2消解后，定容至50 mL，采用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)，混合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定。

1.2.2 微藻的培養(yǎng)與生物量測定

將處于對(duì)數(shù)生長期的埃氏小球藻接入分別含有100 mLBG-11培養(yǎng)基、雞場廢水原液、經(jīng)滅菌水稀釋2倍、4倍、6倍和8倍的雞場廢水的250 mL三角瓶中(共6組處理)，使得每瓶中微藻的細(xì)胞濃度為4.0 ×105cells·mL-1，每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。接種后，將三角瓶放置于溫度25 ℃，光強(qiáng)4 000 lx，光暗比為12 h/12 h的光照培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)7 d。

微藻生物量采用血球計(jì)數(shù)板，吸取20 μL含藻水樣，經(jīng)魯格試劑固定后置于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，每24小時(shí)取樣計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)3次。

1.2.3 微藻油脂含量的測定

微藻細(xì)胞總油脂含量測定采用重量法[9]：取適量藻液，10 000 r·min-1離心5 min后棄上清，使用超純水再次沖洗藻體沉淀，相同條件再次離心5 min，收集藻體沉淀，冷凍干燥制成藻粉；取50 mg藻粉，加入7.5 mL氯仿-甲醇(1∶2，V∶V)溶液，37 ℃下振蕩提取24 h，收集上層有機(jī)相；藻渣再次用7.5 mL氯仿-甲醇溶液提取，合并2次有機(jī)相，加入5 mL氯仿和 9 mL ddH2O，使其比例達(dá)到氯仿∶甲醇：水為2∶2∶1.8(V∶V∶V)；離心后收集氯仿相，于氮吹儀上吹干至恒重，得總脂后稱重，總油脂重量占藻粉重量的百分比即為油脂含量。

1.2.4 尼羅紅熒光染色定性評(píng)估藻細(xì)胞的油脂積累

取800 μL藻液，加入200 μL二甲基亞砜和10 μL尼羅紅丙酮溶液(0.1 g·L-1)，混勻后，于42 ℃水浴加熱5 min。選擇藍(lán)光為激發(fā)光，在熒光顯微鏡(OLYMPUS, BX53)下觀察并拍照藻細(xì)胞[10]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果使用DPS軟件，LSD法分析試驗(yàn)結(jié)果在P<0.05水平上是否具有顯著性差異，使用Excel 2016軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞場廢水主要污染物及含量

對(duì)雞場廢水原液中主要污染物檢測(表2， 表3)顯示，養(yǎng)雞廢水中的TN、TP和COD含量極高，pH為7.6±0.2偏堿性。根據(jù)國家有關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GB 18596—2001)，TN、TP和COD分別超標(biāo)30.8、14.22和9.5倍。廢水中的含量較高的金屬元素有Cr、Cu、K和Na，其中重金屬元素Cr超出標(biāo)準(zhǔn)排放量的1.9倍。

2.2 埃氏小球藻在不同濃度雞場廢水中的生長表型

連續(xù)7 d對(duì)埃氏小球藻在雞場廢水原液及其不同稀釋倍數(shù)液體中的生長表型進(jìn)行測試，結(jié)果(圖1)表明，在培養(yǎng)前3 d內(nèi)，微藻在BG-11培養(yǎng)基內(nèi)的生長優(yōu)于在雞場廢水中的生長。從第4天開始，微藻在8倍稀釋的廢水中生長迅速，第5天的生物量比前一天增加近1倍，并且此后的2 d內(nèi)，呈現(xiàn)出高速增長的趨勢。從第4天開始，微藻在BG-11培養(yǎng)基和6倍稀釋的廢水中生長相比，差異不顯著(P> 0.05)。然而，微藻在4倍稀釋的廢水中生長較慢，從第6天開始明顯增加，但生物量顯著(P< 0.05)低于對(duì)照。在2倍稀釋的廢水和原液中，微藻無法正常生長，甚至出現(xiàn)負(fù)增長。推測可能是由于高濃度廢水中氨氮含量過高，溶液渾濁，通光率差，造成藻細(xì)胞的死亡[11]。而廢水稀釋后，一定程度上降低了氨氮的含量，提高了溶液的通光率，藻細(xì)胞得以有效利用廢水中的氮元素而快速生長。

表2雞場廢水中的非金屬污染物含量

Table2 The content of nonmetallic pollutants in chicken farm wastewater

項(xiàng)目Item濃度/mg·L-1ConcentrationTN636±10.1TP121.76±5.7COD4 200±340

表3雞場廢水中的金屬元素含量

Table3 The content of metallic elements in chicken farm wastewater

項(xiàng)目Item濃度/mg·L-1ConcentrationCr4.37±0.85K3.67±1.21Cu2.31±0.37Na1.89±0.32Ca1.55±0.29Mg1.05±0.49Zn1.02±0.41Fe0.31±0.15

圖1 埃氏小球藻在不同濃度廢水中的生長曲線Fig.1 The growth curves of Chlorella emersonii in different concentration of chicken farm wastewater

2.3 埃氏小球藻對(duì)雞場廢水中總氮總磷的去除效果

2.3.1 培養(yǎng)終期廢水中的總氮?dú)堄嗔?/p>

總氮是衡量養(yǎng)雞廢水污染程度的重要指標(biāo)，過量的氮可導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化、酸化等[12]。對(duì)不同濃度雞場廢水中總氮的殘留量連續(xù)測試顯示，微藻能有效去除廢水中的總氮。由圖2可知，即使在生長條件最差的雞場廢水原液中，埃氏小球藻仍能去除部分氮，其氮含量從636 mg·L-1下降到457 mg·L-1。隨著廢水稀釋度的增大，微藻脫氮的效果進(jìn)一步顯現(xiàn)。用稀釋4倍、6倍和8倍的雞場廢水培養(yǎng)微藻，廢水中總氮含量分別從172 mg·L-1、119 mg·L-1和77 mg·L-1下降到49.1 mg·L-1、26.9 mg·L-1和15.1 mg·L-1。微藻對(duì)不同稀釋倍數(shù)廢水中總氮去除率，差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同稀釋倍數(shù)雞場廢水中總氮含量的變化Fig.2 The change of total nitrogen content in different dilution ratio of chicken farm wastewater

2.3.2 培養(yǎng)終期廢水中的總磷殘余量

總磷含量是廢水中的另一個(gè)重要污染指標(biāo)。從圖3可知，培養(yǎng)7 d后，廢水中總磷含量顯著下降。與廢水中TN去除效果不同，廢水原液和2倍稀釋廢水的TP去除效果顯著，TP分別從起初的121.76 mg·L-1和62 mg·L-1分別減少到41.6 mg·L-1和18.94 mg·L-1(P< 0.05)。這可能是因?yàn)槲⒃鍖?duì)磷酸鹽的吸收利用能力較強(qiáng)，磷酸鹽主要用于ATP合成通路，并且多余的磷在胞內(nèi)可以多聚磷的形式儲(chǔ)存[13]。低稀釋倍數(shù)廢水中的氨氮含量過高，對(duì)微藻生長起到了抑制作用，導(dǎo)致微藻無法較高效率的吸收利用氨氮。

圖3 不同稀釋倍數(shù)下的總磷含量變化Fig.3 The change of total phosphorus content in different dilution ratio of chicken farm wastewater

2.3.3 埃氏小球藻對(duì)不同濃度雞場廢水氮磷的去除率

圖4為微藻對(duì)不同濃度廢水中TN和TP的去除率。微藻對(duì)高稀釋倍數(shù)(稀釋倍數(shù)>4)廢水中N的凈化能力高，以8倍稀釋廢水的凈化效果最佳。微藻對(duì)原液廢水和不同稀釋倍數(shù)廢水的除磷效率均較高，各處理間的TP去除率相差不大。

圖4 埃氏小球藻對(duì)不同稀釋倍數(shù)雞場廢水中TN和TP的去除率Fig.4 TN and TP removal rates by Chlorella emersonii in different dilution ratio of chicken farm wastewater

2.4 不同稀釋度雞場廢水培養(yǎng)下埃氏小球藻總油脂含量

2.4.1 埃氏小球藻在不同濃度廢水下的油脂積累量

對(duì)不同稀釋度雞場廢水培養(yǎng)條件下微藻細(xì)胞油脂含量測試(圖5)表明，廢水中N含量越低，埃氏小球藻細(xì)胞積累油脂越高。BG-11培養(yǎng)基中氮含量為1.5 g·L-1，高于本研究所用雞場廢水原液中的氮含量。已有研究證實(shí)，微藻油脂積累量隨著氮含量的降低而升高，在限氮條件下，微藻油脂含量可顯著增加[14]。本研究中，不同稀釋倍數(shù)廢水中氮含量不同。在培養(yǎng)7 d后，8倍稀釋廢水的氮含量可從77 mg·L-1下降到15 mg·L-1，滿足限氮條件。因此，如圖5所示，微藻的總油脂含量隨著廢水稀釋倍數(shù)的增加而增加，最高含油量可達(dá)34.6%，而BG-11培養(yǎng)基中的油脂含量僅為24.7%。

圖5 不同稀釋倍數(shù)廢水培養(yǎng)下埃氏小球藻的油脂含量Fig.5 The oil content of Chlorella emersonii cultured in different dilution ratios of chicken farm wastewater

2.4.2 微藻細(xì)胞積累油脂的尼羅紅熒光染色確認(rèn)

尼羅紅是一種親脂性的熒光染料。與脂類物質(zhì)以及各種脂肪酸結(jié)合后，在激發(fā)波長543 nm的激發(fā)下，顯示強(qiáng)烈桔色熒光[15]。由圖6可以看出，在BG-11培養(yǎng)基、0倍和2倍稀釋廢水中，藻細(xì)胞內(nèi)很少或幾乎觀察不到橘黃色亮點(diǎn)(油滴)，而在高稀釋倍數(shù)廢水中的微藻細(xì)胞油滴較大，密集分布，呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的橘黃色熒光，油滴數(shù)量和亮度隨著稀釋倍數(shù)的增大而增加，這說明高稀釋倍數(shù)的廢水中滿足微藻高效產(chǎn)油的限氮條件。

圖6 尼羅紅熒光染色示埃氏小球藻胞內(nèi)油脂F(xiàn)ig.6 The Nile red fluorescent staining showed the intracellular oil body in Chlorella emersonii

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)今集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，治理廢水的任務(wù)十分艱巨。微藻處理畜禽養(yǎng)殖廢水是一個(gè)可行的方案。畜禽廢水的特點(diǎn)主要是氮磷重金屬、固體懸浮物及化學(xué)需氧量含量高[16]。因此，針對(duì)其污染組分的特點(diǎn)，選擇合適的微藻進(jìn)行處理十分重要。但是，大多數(shù)畜禽廢水存在氨氮含量過高、固體懸浮物過多的情況，導(dǎo)致許多微藻無法直接在其原液中生存。例如，Gonzalez等[17]利用藻菌系統(tǒng)處理豬場廢水，發(fā)現(xiàn)微藻無法在原液及2倍稀釋廢水中生長，推測可能是高pH值和氨氮濃度抑制了微藻的生長。程海翔等[18]將柵藻Desmodesmussp.CHX1 接種于原液和高稀釋倍數(shù)的養(yǎng)豬廢水中，發(fā)現(xiàn)在高稀釋倍數(shù)的廢水中，微藻可快速生長，未出現(xiàn)抑制效應(yīng)，而微藻在原液中第6天才開始緩慢生長。以上研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似，即在高稀釋倍數(shù)的畜禽養(yǎng)殖廢水中，埃氏小球藻可快速生長，生物量達(dá)2.51 × 106cells·mL-1,然而，未稀釋和低稀釋倍數(shù)的廢水對(duì)微藻有明顯的抑制效應(yīng)。由此可見，對(duì)大多數(shù)畜禽廢水進(jìn)行稀釋等預(yù)處理，有利于微藻迅速生長，達(dá)到脫氮除磷、獲得生物質(zhì)的目的。

在本研究中，埃氏小球藻對(duì)TN和TP的去除率最高可以達(dá)到80%及75%，這與前人的研究結(jié)果相似[19]。但是，最高去除率發(fā)生于稀釋倍數(shù)較高的處理，即8倍稀釋的雞場廢水中。在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中，應(yīng)當(dāng)兼顧效率與成本，使用大量的水去對(duì)廢水進(jìn)行稀釋，不能滿足綠色節(jié)約的理念。稀釋倍數(shù)為4的廢水養(yǎng)殖微藻，TN和TP去除率為71.45%和64.6%，可通過延長培養(yǎng)時(shí)間來提高清除率。相對(duì)于高稀釋倍數(shù)廢水而言，顯然這是一種節(jié)約水資源的處理方式。進(jìn)一步應(yīng)深入研究微藻去除廢水污染物的機(jī)理以及微藻凈化畜禽廢水優(yōu)化實(shí)施方案。

總之，本研究表明，埃氏小球藻能有效去除雞場廢水中氮磷，特別是在廢水稀釋的情況下，效果更顯著，且微藻細(xì)胞能高水平積累油脂。這為在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中建立兼顧水資源節(jié)約、環(huán)保、高效凈化畜禽廢水工程以及聯(lián)產(chǎn)生物燃油優(yōu)化工藝提供了科學(xué)參考。