孫紫薇，翁麗麗，張 楠，陳 麗，侯曉琳

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

龍膽為條葉龍膽（Gentiana ma shurica Kitag.）、龍膽（Geniana scabra Bge.）、三花龍膽（Geniiarurtriflora Pall.）和滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.）的干燥根和根莖。前3種習(xí)稱“龍膽”，后1種習(xí)稱“堅(jiān)龍膽”[1]。條葉龍膽主要分布于黑龍江、遼寧、吉林、山西、陜西、

山東等?。积埬?、三花龍膽主要分布于黑龍江、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古等??；堅(jiān)龍膽主要分布于四川、云南、貴州等省。龍膽最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，梁代陶弘景《名醫(yī)別錄》也都有記載，在臨床上，應(yīng)用的制劑主要有龍膽瀉肝丸（湯、顆粒）、龍膽散和龍澤熊膽膠囊等制劑[2]。龍膽中主要藥效成分為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)[3-5]，具有抗炎鎮(zhèn)痛[6-7]，健胃[8]，抗病毒[9]，抗腫瘤[10]，促進(jìn)傷口愈合[11]等作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀Prominence-ILC-2030（島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司）；JA2603B電子天平（d = 0.000 1g）（上海天美天平儀器有限公司）；FA1004B電子天平（d = 0.000 01 g）（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Water Purifier 實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用超純水機(jī)；指紋圖譜軟件、統(tǒng)計(jì)軟件SPSS。

1.2 試藥

1.2.1 對(duì)照品 當(dāng)藥苷（規(guī)格：20 mg，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）；獐牙菜苦苷（規(guī)格：20 mg，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.2.2 試劑 甲醇分析純（北京化工廠）；色譜甲醇（SK chemicals）；色譜乙腈（Fisher chemicals）；水為超純水。

1.3 藥材 以下材料收集后，置于陰涼處陰干，粉碎過(guò)篩，備用，所有采集藥材經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定，均為龍膽（Geniana scabra Bge.）。見(jiàn)表1。

表1 龍膽不同來(lái)源材料

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)藥苷與獐牙菜苦苷含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取當(dāng)藥苷、獐牙菜苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇均制成每1 mL含0.025 mg的溶液，搖勻即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取龍膽粉末約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇4 mL，超聲提取10 min，放冷后過(guò)濾，濾渣加入甲醇4 mL，再次超聲提取10 min，放冷后，濾過(guò)。合并續(xù)濾液，濾液置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得。

2.1.3 色譜條件及色譜峰歸屬 色譜柱：Agilent Innoval C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（20：80），流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。 見(jiàn)圖1（插頁(yè)二）。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 取當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣4、6、8、10、12、14 μL，按2.1.3項(xiàng)下測(cè)定相應(yīng)峰面積，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表2。

表2 回歸方程、線性范圍

2.2.2 精密度試驗(yàn) 分別吸取2.1.1項(xiàng)下當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液，按2.1.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。當(dāng)藥苷RSD = 0.16%，獐牙菜苦苷RSD = 0.55%，結(jié)果表明，儀器具有良好的精密度。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一龍膽供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、12、24 h依法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。當(dāng)藥苷RSD = 0.37%，獐牙菜苦苷RSD = 0.48%。表明供試品溶液中的當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取龍膽粉末按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，依次進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果當(dāng)藥苷RSD = 0.87%，獐牙菜苦苷RSD = 1.30%。表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知龍膽樣品6份，精密稱定，加入適量的當(dāng)藥苷、獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下方法制備，測(cè)定當(dāng)藥苷、獐牙菜苦苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果當(dāng)藥苷平均回收率為96.63%，RSD值為1.21%；獐牙菜苦苷回收率為97.40%，RSD值為1.31%。見(jiàn)表3，表4。

2.3 樣品含量測(cè)定 分別取不同地區(qū)、不同部位的龍膽藥材粉末，按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件測(cè)定當(dāng)藥苷、獐牙菜苦苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4 指紋圖譜

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Innoval C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（C），（0～11 min，2% C→5% C；11～30 min，5% C → 20% C；30～ 65 min ，20% C → 80% C；65～65.01 min，80% C→2% C；65.01～80 min， 2% C）梯度洗脫。流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表3 當(dāng)藥苷的加樣回收率（n = 6）

表4 獐牙菜苦苷的加樣回收率（n = 6）

表5 龍膽中當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷含量測(cè)定結(jié)果

2.4.2 供試品溶液制備 同2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備。

2.4.3 不同產(chǎn)地龍膽根部及莖葉藥材指紋圖譜的建立 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）對(duì)不同產(chǎn)地龍膽根的指紋圖譜進(jìn)行分析，得到每個(gè)產(chǎn)地的對(duì)照譜圖，見(jiàn)圖2（插頁(yè)二）。

2.4.4 相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)8批不同產(chǎn)地龍膽根對(duì)照?qǐng)D譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以R為參考譜圖計(jì)算相似度，計(jì)算每個(gè)產(chǎn)地8批樣品間的相似度，不同產(chǎn)地龍膽根部指紋圖譜，其相似度值均大于0.85，以每個(gè)產(chǎn)地的對(duì)照譜圖作為該產(chǎn)地龍膽藥材根部的特征指紋圖譜。不同產(chǎn)地龍膽藥材根部指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.855～0.976之間，相似度較好，其中吉林省白山市靖宇縣與對(duì)照?qǐng)D譜間的相似度最低，為0.855，其余7個(gè)產(chǎn)地均在0.880以上，表明吉林省白山市靖宇縣較吉林省其他7個(gè)地區(qū)具有一定特殊性。另外，8個(gè)產(chǎn)地之間相似度均在0.681～0.986之間波動(dòng)，表明吉林省內(nèi)不同產(chǎn)地的龍膽藥材根部的HPLC指紋圖譜具有一定差異。這可能與藥材的產(chǎn)地及年份有關(guān)。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.4.5 系統(tǒng)聚類(lèi)分析 指紋圖譜反映了藥材中大部分成分的信息，不同產(chǎn)地龍膽藥材根部指紋圖譜共有峰的峰面積，見(jiàn)表7。將其共有峰總面積通過(guò)SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3（插頁(yè)二）。

3 小結(jié)

3.1 色譜條件分離 本文通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[12-18]，以乙腈-水-醋酸（10：105：1）為流動(dòng)相，當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷成分未完全分離，出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象，且壓力線不穩(wěn)定，經(jīng)反復(fù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與酸度有關(guān)。后改變流動(dòng)相，以甲醇-水（20：80）為色譜條件，當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷完全分離。

3.2 不同產(chǎn)地龍膽根及根莖中當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷含量與生態(tài)環(huán)境的相關(guān)性 不同產(chǎn)地龍膽根及根莖中當(dāng)藥苷及獐牙菜苦苷含量的高低與其生態(tài)環(huán)境有一定的關(guān)系，獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷在莖葉中含量較低，遠(yuǎn)低于根及根莖中的含量；莖葉中幾乎未檢測(cè)到當(dāng)藥苷的含量；花中未檢測(cè)到當(dāng)藥苷、獐牙菜苦苷的含量。

表6 8批樣品根部指紋圖譜的相似度

表7 不同產(chǎn)地樣品指紋圖譜的共有峰面積

3.3 指紋圖譜與聚類(lèi)分析 指紋圖譜與聚類(lèi)分析是現(xiàn)代分析統(tǒng)計(jì)常用的手段之一，能夠較充分的提取物質(zhì)獨(dú)特的信息。二者的結(jié)合為龍膽的產(chǎn)地識(shí)別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的思路和模式[19-20]。

不同產(chǎn)地的龍膽HPLC指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜間的相似度均在0.855以上，說(shuō)明該指紋圖譜可以代表吉林省內(nèi)各產(chǎn)地龍膽藥材的鑒別特征。

從圖3可知，吉林省不同產(chǎn)地龍膽藥材所含各種有效成分分類(lèi)基本相同，但含量上有一定差別，8個(gè)產(chǎn)地中七星百草園指紋圖譜共有峰總面積最高，吉林市江密峰鎮(zhèn)次之。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，隨著閾值的增大，8個(gè)產(chǎn)地樣品大致可以分為兩大類(lèi)，七星百草園、吉林市江密峰鎮(zhèn)、長(zhǎng)春市九臺(tái)區(qū)、吉林市龍?zhí)秴^(qū)楊木鄉(xiāng)與吉林市昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)為一類(lèi)，吉林省永吉縣、吉林省蛟河天崗鎮(zhèn)與吉林省白山市靖宇縣為一類(lèi)。前5個(gè)產(chǎn)地又可分為兩類(lèi)，其中七星百草園單獨(dú)為一類(lèi)，吉林市江密峰鎮(zhèn)、長(zhǎng)春市九臺(tái)區(qū)、吉林市龍?zhí)秴^(qū)楊木鄉(xiāng)與吉林市昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)為一類(lèi)；后3個(gè)產(chǎn)地也可分為兩類(lèi)，吉林省永吉縣單獨(dú)一類(lèi)，吉林省蛟河天崗鎮(zhèn)與吉林省白山市靖宇縣為一類(lèi)。