侯?lèi)?ài)榮 邢曄忠 吳雪松

中圖分類(lèi)號(hào) R917；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）23-3212-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.10

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素含量的方法。方法：采用高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器（HPLC-CAD）法。色譜柱為T(mén)hermo Hypersil BDS C18，流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH至4.5，梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，CAD霧化器溫度為35 ℃，氣壓為（59.6±0.1） psi，檢測(cè)頻率為10 Hz，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.42～16.80、0.28～11.20、0.16～6.20、0.98～39.40、1.02～41.00、0.11～4.40、0.10～3.80 μg/mL（r≥0.999 1）；檢測(cè)限分別為0.03、0.02、0.02、0.03、0.03、0.02、0.02 μg/mL，定量限分別為0.11、0.06、0.06、0.10、0.11、0.08、0.07 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（48 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均<2.0%（n=6或n=7）；平均回收率為98.61%～99.76%，RSD為1.11%～1.51%（n=6）。結(jié)論：建立的方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于風(fēng)濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器法；風(fēng)濕定片；水楊苷；毒藜?jí)A；丹皮酚；歐前胡素；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of glycyrrhizic acid， salicin， glycyrrhetinic acid， chenopodium， paeonol， imperatorin and isoimperatorin in Fengshiding tablet. METHODS： HPLC-CAD method was adopted. The determination was performed on Thermo Hypersil BDS C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-10 mmol/L ammonium formate （pH value adjusted to 4.5 using formic acid， gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. CAD atomizer temperature was 35 ℃， and air pressure was （59.6±0.1） psi. The detection frequency was 10 Hz， and sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of glycyrrhizic acid， salicin， glycyrrhetinic acid， chenopodium， paeonol， imperatorin and isoimperatorin were 0.42-16.80， 0.28-11.20， 0.16-6.20， 0.98-39.40， 1.02-41.00， 0.11- 4.40， 0.10-3.80 μg/mL（r≥0.999 1）， respectively. The detection limits were 0.03， 0.02， 0.02， 0.03， 0.03， 0.02， 0.02 μg/mL， respectively； quantitation limits were 0.11， 0.06， 0.06， 0.10， 0.11， 0.08， 0.07μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （48 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6 or n=7）. Average recoveries rate were 98.61%-99.76%， and RSDs were 1.11%-1.51% （n=6）. CONCLUSIONS： The established method is simple， sensitive， accurate， and can be used for simultaneous determination of glycyrrhizic acid， salicin， glycyrrhetinic acid， chenopodium， paeonol， imperatorin and isoimperatorin in Fengshiding tablet.

KEYWORDS HPLC-CAD； Fengshiding tablet； Salicin； Chenopodium； Paeonol； Imperatorin； Content determination

風(fēng)濕定片由八角楓、徐長(zhǎng)卿、白芷及甘草這4味中藥組成，有散風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效，用于風(fēng)濕阻絡(luò)所致的痹病、癥見(jiàn)關(guān)節(jié)疼痛以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肋神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛見(jiàn)上述證候者[1]。研究表明，毒藜?jí)A為八角楓中松弛肌肉的活性成分，也是主要毒性成分[2]，水楊苷為八角楓解熱鎮(zhèn)痛的主要活性成分，對(duì)關(guān)節(jié)炎有治療作用[3]；丹皮酚為徐長(zhǎng)卿中主要活性成分，具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[4]；以歐前胡素及異歐前胡素為代表的香豆素類(lèi)成分是白芷鎮(zhèn)痛抗炎的活性成分[5]；甘草酸及甘草次酸是甘草的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用[6]。風(fēng)濕定片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中[1]，其含量測(cè)定項(xiàng)僅以丹皮酚為指標(biāo)性成分，且關(guān)于風(fēng)濕定片質(zhì)量研究的文獻(xiàn)也未見(jiàn)3種以上的多成分質(zhì)量控制[7-9]，由于中藥復(fù)方制劑化學(xué)成分復(fù)雜，僅控制其中少量成分含量，很難全面反映其質(zhì)量。

電霧式檢測(cè)器（CAD）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型檢測(cè)器，與傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器比較，具有靈敏高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[10]。本試驗(yàn)建立高效液相色譜（HPLC）-CAD法同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素的含量，以期為完善風(fēng)濕定片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

3000 HPLC儀，包括Corona Veo CAD（美國(guó)Thermo Fisher公司）；KQ -400DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP千分之一天平、CPA225D十萬(wàn)分之一天平、MSE百萬(wàn)分之一天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

風(fēng)濕定片（陜西君碧莎制藥有限公司，規(guī)格：0.22 g×16片×2板/盒，丹皮酚含量≥1.0 mg/片，共6批，批號(hào)分別為20170602、20170712、20170923、20180310、2018- 0325、20180516；江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.22 g×12片×2板/盒，丹皮酚含量≥1.0 mg/片，共3批，批號(hào)分別為20171109、20171222、20180320）； 甘草酸對(duì)照品（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：070-06021，純度：99%）；水楊苷對(duì)照品（批號(hào)：132590050，純度：99%）、毒藜?jí)A對(duì)照品（批號(hào)：458980010，純度：98%）均購(gòu)自比利時(shí)Acros公司；甘草次酸對(duì)照品（批號(hào)：110723-201715，純度：98%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-201407，純度：97%）、歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110826-201616，純度：99%）、異歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110827-201812，純度：98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，乙腈、甲酸、甲酸銨為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-10 mmol/L甲酸銨（B，甲酸調(diào)pH至4.5），梯度洗脫（0～8 min，15% A；8～30 min，15%～25% A；30～35 min，25%～30% A；35～45 min，30%～55% A；45～50 min，55%～70% A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL ；CAD霧化器溫度：35 ℃，氣壓：（59.6±0.1） psi，檢測(cè)頻率：10 Hz。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取甘草酸、水楊苷、甘草次酸、歐前胡素及異歐前胡素對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成含甘草酸、水楊苷、甘草次酸、歐前胡素及異歐前胡素分別為0.84、0.56、0.31、0.22、0.19 mg/mL的對(duì)照品貯備液；分別精密稱取毒藜?jí)A及丹皮酚適量置于10 mL量瓶中，并分別精密移取甘草酸、水楊苷、甘草次酸、歐前胡素及異歐前胡素的對(duì)照品貯備液各1.0 mL置于同一10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成含甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素質(zhì)量濃度分別為0.084、0.056、0.031、0.197、0.205、0.022、0.019 mg/mL的混合對(duì)照品母液；精密移取混合對(duì)照品母液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素、異歐前胡素質(zhì)量濃度分別為0.008 4、0.005 6、0.003 1、0.019 7、0.020 5、0.002 2、0.001 9 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10片，去除糖衣并精密稱定，研細(xì)，取約0.2 g，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇30 mL，45 ℃超聲（功率：220 W，頻率：30 kHz） 處理40 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例及制法[1]分別制備不含八角楓、徐長(zhǎng)卿、白芷及甘草的4種陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法提取，分別得缺八角楓、缺徐長(zhǎng)卿、缺白芷及缺甘草的陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（批號(hào)：20170602）和缺八角楓、缺徐長(zhǎng)卿、缺白芷、缺甘草的陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素與其他組分色譜峰的分離度均不低于1.5，理論板數(shù)以甘草酸計(jì)不低于 8 000，陰性對(duì)照溶液圖譜顯示各陰性樣品均無(wú)干擾。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品母液1.0 mL，分別置于5、10、25、50、100、200 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，得不同質(zhì)量濃度的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果， 甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素的檢測(cè)限分別為0.03、0.02、0.02、0.03、0.03、0.02、0.02 μg/mL，定量限分別為0.11、0.06、0.06、0.10、0.11、0.08、0.07 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素峰面積的RSD分別為1.52%、1.11%、1.33%、0.82%、0.91%、1.58%、1.19%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170602）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.92%、1.48%、1.32%、1.34%、1.21%、1.62%、1.78%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：20170602）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素含量的平均值分別為0.46、0.31、0.16、1.08、1.14、0.12、0.10 mg/片， RSD分別為1.39%、1.02%、1.32%、1.21%、1.09%、1.63% 、1.74%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20170602）適量，共6份，每份約0.2 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取9批樣品各10片，除去糖衣，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)器的選擇

取各成分對(duì)照品溶液采用DAD進(jìn)樣并進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，甘草酸與甘草次酸的最大吸收波長(zhǎng)均為250 nm，水楊苷、毒藜?jí)A、丹皮酚最大吸收波長(zhǎng)分別為269、259、274 nm，而歐前胡素、異歐前胡素分別在248、301 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，將以上各波長(zhǎng)下樣品的DAD圖譜與CAD圖譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，CAD獲得的色譜峰個(gè)數(shù)顯著多于DAD，且靈敏度高、基線更平穩(wěn)，故選擇CAD進(jìn)行各成分的含量測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相的選擇

2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]風(fēng)濕定片的含量測(cè)定是以水-乙腈等度洗脫，但在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，除丹皮酚外，其他6種成分在該條件下均難以實(shí)現(xiàn)基線分離，且峰形拖尾。參考文獻(xiàn)[7-9]，本試驗(yàn)考察了甲醇-三乙胺、甲醇-純水及乙腈-甲酸等流動(dòng)相系統(tǒng)，均難以實(shí)現(xiàn)7種成分的基線分離，繼而本試驗(yàn)對(duì)甲醇-10 mmol/L甲酸銨、乙腈-10 mmol/L甲酸銨、甲醇-10 mmol/L乙酸銨以及乙腈-10 mmol/L乙酸銨等流動(dòng)相體系進(jìn)行考察。結(jié)果，乙腈-10 mmol/L甲酸銨系統(tǒng)下各成分分離度較佳。本試驗(yàn)還考察了采用甲酸分別調(diào)節(jié)pH值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0及5.5，結(jié)果pH值為4.5時(shí)基線平穩(wěn)，各色譜峰對(duì)稱度及理論板數(shù)均為最佳，故選擇乙腈-10 mmol/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH至4.5）為流動(dòng)相。

3.3 色譜柱的選擇

文獻(xiàn)[7-9]均采用Diamonsil C18為色譜柱進(jìn)行分析，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)該色譜柱條件下水楊苷峰形拖尾，且歐前胡素與異歐前胡素?zé)o法實(shí)現(xiàn)基線分離，在多種流動(dòng)相系統(tǒng)中均難以改善。鑒于此，本試驗(yàn)也對(duì)Waters XBridge C18、Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18以及Thermo Hypersil BDS C18等不同色譜柱進(jìn)行考察比較，結(jié)果顯示Thermo Hypersil BDS C18色譜柱可以滿足檢測(cè)要求。

3.4 供試品制備方法的選擇

本試驗(yàn)考察了體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%及純甲醇4種提取溶劑對(duì)各成分的提取效果，結(jié)果顯示，70%甲醇對(duì)風(fēng)濕定片中7種成分的提取效果最佳。本試驗(yàn)還考察了30、40、50 min等不同超聲處理時(shí)間以及40、45、50 ℃等不同超聲加熱溫度對(duì)待測(cè)成分提取的影響，結(jié)果45 ℃超聲40 min即可將7種待測(cè)成分提取完全，故選擇70%甲醇45 ℃超聲40 min為供試品制備方法，且本方法較2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]及文獻(xiàn)[7，9]提取更加完全，且操作簡(jiǎn)便易行。

3.5 含量測(cè)定結(jié)果分析

結(jié)果顯示，丹皮酚含量均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn)（1.0 mg/片）[1]。與文獻(xiàn)[7-9]的檢測(cè)結(jié)果比較，甘草酸含量與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，毒藜?jí)A含量略有降低，丹皮酚及歐前胡素含量比文獻(xiàn)有所升高。除異歐前胡素外，兩個(gè)不同廠家樣品中的其他6種成分含量無(wú)顯著差異，同一廠家不同批次樣品亦無(wú)明顯的批間差異；本品中異歐前胡素含量相對(duì)較低，在本品的制劑工藝中[1]，未對(duì)白芷進(jìn)行提取，而直接以細(xì)粉與其他藥材的提取濃縮液混合制粒壓片，可能由于原藥材質(zhì)量批間差異且本試驗(yàn)超聲提取不充分而導(dǎo)致部分批次樣品中異歐前胡素未檢出。

本試驗(yàn)建立了HPLC-CAD法同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜?jí)A、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素的含量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為風(fēng)濕定片的質(zhì)量研究提供了更加全面的方法。后續(xù)試驗(yàn)中將采用所建立的方法對(duì)更多廠家樣品進(jìn)行分析檢測(cè)與數(shù)據(jù)積累，以期形成更加準(zhǔn)確、完善的風(fēng)濕定片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典： 一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：686-687.

[ 2 ] 王其勇，許亞玲. HPLC法測(cè)定八角楓藥材不同藥用部位中L（-）-八角楓堿的含量[J].中國(guó)藥房，2016，27（27）：3877-3879.

[ 3 ] AKAO T， YOSHINO T， KOBASHI K， et al. Evaluation of salicin as an antipyretic prodrug that does not cause gastric injury[J]. Planta Med，2002，68（8）：714-718.

[ 4 ] 金賢蘭.徐長(zhǎng)卿藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26（19）：2947-2948.

[ 5 ] 朱藝欣，李寶莉，馬宏勝，等.白芷的有效成分提取、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（31）：159-162、166.

[ 6 ] 高雪巖，王文全，魏勝利，等.甘草及其活性成分的藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（21）：2695-2700.

[ 7 ] 梁從慶，李書(shū)淵，房志堅(jiān). HPLC法測(cè)定風(fēng)濕定片中毒藜?jí)A的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15（4）：268- 270.

[ 8 ] 葉偉峰，姚建標(biāo).高效液相色譜法測(cè)定風(fēng)濕定片中丹皮酚的含量[J].兒科藥學(xué)雜志，2008，14（2）：41-43.

[ 9 ] 曾上敏，秦斯民，曹華玲. HPLC 法同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量[J].山東化工，2017，46（11）：98-100、103.

[10] 劉路，高旋，楊永健. HPLC-電霧式檢測(cè)器的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43（3）：227-231.

（收稿日期：2018-08-17 修回日期：2018-09-27）

（編輯：余慶華）