陳云霞，馬 鑫，楊明睿

SSR（Simple sequence repeat）即簡單序列重復(fù)，通常又被稱為微衛(wèi)星或短串聯(lián)重復(fù)DNA，是以1～6個堿基為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛存在于各種真核生物的基因組［1-2］，它不僅數(shù)量豐富，多態(tài)性高，相比于AFLP、RAPD、ISSR等分子標記技術(shù)具有更高的可靠性［3-4］.近年來，SSR在植物遺傳研究方面成為一種比較常見的模式，是進行分子標記輔助育種和種質(zhì)資源保護研究的重要工具.

銀縷梅是金縷梅科具有較高科研價值和觀賞價值的國家一級保護植物，是我國僅存的活化石樹種.銀縷梅分布區(qū)狹窄，僅在江蘇宜興、常州溧陽、安徽金寨和浙江安吉縣龍王山的狹窄地域有少量野生植株，且開花周期長，平均2～5年開一次花，人工栽培要求也很高.在環(huán)境破壞和生物破壞等種種不利于銀縷梅生長的因素下，銀縷梅已處于極度瀕危狀態(tài).基于上述原因開展銀縷梅遺傳多樣性的研究，制定針對性種質(zhì)資源保護方案刻不容緩.本研究擬通過正交實驗設(shè)計及單因子試驗，建立銀縷梅的SSRPCR反應(yīng)最佳體系，為進一步開展銀縷梅遺傳多樣性研究以及建立銀縷梅保護機制提供前期基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

銀縷梅植物材料均采自江蘇省宜興林場大壟溝.植物葉片采用硅膠快速干燥保存.

1.2 方法

（1）銀縷梅的DNA提取.取硅膠干燥的植物葉片0.1g，用研缽研磨粉碎，采用DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）抽提基因組DNA.DNA的濃度和質(zhì)量采用紫外分光光度法和1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測.

（2）銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)體系的建立.對銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)4因素（Ex-Taq Mix、DNA、引物-F、引物-R）進行4濃度梯度實驗，共16個處理，反應(yīng)體系如表1～2所示.該試驗所用引物為課題組前期在轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上設(shè)計并篩選的.

表1 銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗L16（44）設(shè)計

表2 銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗L16（44）因素水平組合處理

（3）銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)單因子試驗設(shè)計.對正交試驗建立的SSR-PCR反應(yīng)體系進行單因子試驗，分析不同因素對銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)的影響如表3所示.

表3 銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)體系單因子試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與檢測結(jié)果

利用QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒提取6份銀縷梅葉片的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示DNA條帶清晰完整，質(zhì)量較高，如圖1所示，可用于進一步開展SSR-PCR反應(yīng).

圖1 銀縷梅DNA電泳檢測

2.2 銀縷梅SSR-PCR正交實驗

銀縷梅SSR-PCR 4因素4梯度正交試驗如圖2所示，16個處理中除1、2、5、9號處理無法擴增出條帶外，其他處理均能擴增出條帶，且每個處理重復(fù)效果基本一致.對有擴增結(jié)果的12個處理進行進一步比較，發(fā)現(xiàn)處理16條帶最清晰，多態(tài)性最好，故選取處理16進行銀縷梅SSRPCR反應(yīng)體系單因子試驗，分析不同因素對銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)的影響.

圖2 銀縷梅SSR-PCR 4因素4梯度正交試驗電泳

由圖2可知，16條帶的配量為DNA 5.0μL（20ng/μL），Ex-Taq Mix15.0μL，引物-F 2.0μL（10μmol·L-1），引物-R 2.0μL（10μmol·L-1）.

2.3 銀縷梅SSR-PCR單因子實驗結(jié)果

不同范本DNA濃度，Ex-Taq Mix、引物-F、引物-R對銀縷梅反應(yīng)均有一定影響，但主要影響因素為范本DNA，結(jié)果如圖3所示.

圖3 銀縷梅SSR-PCR單因子試驗電泳

（1）范本DNA對銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)的影響.最佳DNA范本濃度取決于物種基因組大小及DNA范本純度.范本量過低，因子碰撞的幾率會降低，擴增產(chǎn)物少或不穩(wěn)定；范本量過高，又會相應(yīng)增加非特異性產(chǎn)物的擴增.比較25μL反應(yīng)體系中范本DNA的4個濃度梯度2.5μL、3.5μL、4.5μL、5.5μL（20ng/μL）效果，以4.5μL（20ng/μL）的DNA范本量為最佳.

（2）Ex-Taq Mix對銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)的影響.Ex-Taq Mix用量直接決定擴增反應(yīng)成敗，大量使用高濃度Ex-Taq Mix不僅成本高，造成較大的負擔，而且易產(chǎn)生其他非特異性的擴增產(chǎn)物，但如果Ex-Taq Mix濃度較低，則會導(dǎo)致無法完成產(chǎn)物合成或者降低合成效率.Ex-Taq Mix用量在14.5～16.0μL范圍時，以15.5μL效果最好，條帶最亮、多態(tài)性最好.

（3）引物對銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)影響.引物濃度會直接影響PCR結(jié)果可靠性.濃度較低時會引起無法檢測出所有SSR位點，擴增效率低，會產(chǎn)生彌散的條帶；濃度較高時會產(chǎn)生錯配和非特異性擴增，且會增加引物二聚體的形成概率，從而降低擴增的效率.設(shè)置1.5μL、1.8μL、2.1μL、2.4μL（10μmol/L）4個梯度，濃度在2.4μL時條帶最多且清晰，位點較多，所以引物2.4μL（10μmol/L）是銀縷梅SSR-PCR體系引物最適濃度.

3 討論

銀縷梅分布區(qū)狹小，呈間斷島嶼狀散布于天目山北段及大別山東南部，現(xiàn)存種群個體數(shù)量極少，已瀕于滅絕.瀕危物種特別是高度特化的單種屬植物在分類或遺傳上最為獨特而不可替代，所以對其的研究和保護尤為重要.然而近年來針對銀縷梅開展的遺傳多樣性研究相對較少，還未提出科學有效的保護策略.通過本文的研究結(jié)果表明，銀縷梅SSR-PCR反應(yīng)最佳體系為（25μL）：Ex-Taq Mix 15.5μL，DNA 4.5μL（20ng/μL），引物-F 2.4μL（10μmol/L），引物-R 2.4μL（10μmol/L）.影響實驗結(jié)果的每一種因素在上文已經(jīng)分析得出，Ex-Taq Mix用量直接決定擴增反應(yīng)成敗.本實驗優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系與波斯銀縷梅的反應(yīng)體系相比，反應(yīng)體系比波斯銀縷梅大，體系反應(yīng)時間也比波斯銀縷梅長，但本實驗采用混合PCR MasterMix擴增體系，使用方法更加簡單，操作更加簡便，反應(yīng)所需要的時間也大大減少，實驗效果也已經(jīng)達到預(yù)期效果，優(yōu)化后的反應(yīng)體系，多態(tài)性位點比較清晰.