尤炬炬，郭遠(yuǎn)明，冉麗紅，金衍健，孫秀梅

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021)

日本黃姑魚 (Nibea japonica) ，俗稱黑毛鲿，屬鱸形目，石首魚科，是石首魚科黃姑魚屬的一種魚類[1]。日本黃姑魚是一種具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖品種，國內(nèi)外對(duì)日本黃姑魚的研究比較廣泛，不僅涉及育苗、養(yǎng)殖，還有對(duì)營養(yǎng)品質(zhì)等方面的研究，但是對(duì)日本黃姑魚急性毒性效應(yīng)方面的相關(guān)研究較少[2]。

由于日本黃姑魚的經(jīng)濟(jì)效益好，深受養(yǎng)殖戶的喜愛。對(duì)日本黃姑魚的研究工作開展至今已經(jīng)數(shù)十年[3]。目前國內(nèi)外對(duì)日本黃姑魚的研究主要涉及的是基礎(chǔ)生物學(xué)、育苗技術(shù)[4]、養(yǎng)殖技術(shù)[5]、能量學(xué)研究[6]、營養(yǎng)品質(zhì)和加工技術(shù)等方面[7]。作為經(jīng)濟(jì)魚類，對(duì)日本黃姑魚的研究也更加深入。張彩明等研究了Cr6+對(duì)日本黃姑魚超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的影響[8-9]。査智輝等研究了高錳酸鉀、二溴海因等對(duì)日本黃姑魚幼魚的急性毒性[1,10]。王志錚等研究了Hg2+、Zn2+、Cr6+對(duì)黃姑魚幼魚的急性致毒效應(yīng)[11]。但是目前尚未見石化工業(yè)相關(guān)污染物對(duì)日本黃姑魚的毒性效應(yīng)，尤其是石化工業(yè)特征污染物、苯、甲苯、二甲苯等對(duì)日本黃姑魚毒性效應(yīng)的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)選擇乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和苯這6種石化工業(yè)特征污染物，研究其對(duì)日本黃姑魚的急性毒性效應(yīng)，以期為養(yǎng)殖環(huán)境評(píng)價(jià)和相關(guān)污染事故處理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試生物及試驗(yàn)藥劑

本試驗(yàn)日本黃姑魚是2017年8月底從浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒養(yǎng)殖試驗(yàn)場運(yùn)回的日本黃姑魚作為試驗(yàn)生物，充氧立即運(yùn)回浙江省海洋水產(chǎn)研究所室內(nèi)暫養(yǎng)，先放在經(jīng)消毒清洗過的聚乙烯塑料缸(容積80 L)內(nèi)暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間自然光照，停止投餌，24h換水1/3，防止試驗(yàn)結(jié)果受到外界其它污染物的影響。挑選無傷病的健壯個(gè)體作為試驗(yàn)對(duì)象，規(guī)格為體長(9.81±0.92) cm，暫養(yǎng)4～5天備用。

試驗(yàn)毒物為選取的石化工業(yè)特征污染物乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。氯化鈉(優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 試驗(yàn)用水及容器

試驗(yàn)用海水取自浙江省海水增養(yǎng)殖基地-浙江省舟山市普陀區(qū)西軒島附近的海域，經(jīng)過72h沉淀、二級(jí)砂濾，經(jīng)測定所用海水中不含有試驗(yàn)用石化工業(yè)特征污染物乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯。室內(nèi)開空調(diào)保持室溫22 ℃，水溫19.1～19.8 ℃，鹽度27.8～29.3，pH 值7.87～8.13，DO >7.8 mg/L[4]。

試驗(yàn)容器為50 cm× 30 cm× 30 cm的有機(jī)玻璃缸，實(shí)驗(yàn)前，所有用于實(shí)驗(yàn)的玻璃缸、工具等均以重鉻酸鉀溶液浸泡24h后用水反復(fù)沖洗，最后用純凈水沖洗干凈后備用。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)方法按照《近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(GB 17378.7-2007 海洋監(jiān)測規(guī)范 第7部分)》[12]進(jìn)行。查找相關(guān)文獻(xiàn)并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定毒物的試驗(yàn)濃度范圍，及時(shí)記錄試驗(yàn)期間日本黃姑魚的情況。試驗(yàn)在玻璃缸內(nèi)放10 L水，10條日本黃姑魚。

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選定的濃度范圍，按照濃度等差間距法[13-14]，將乙基苯設(shè)30 、40 、50 、60 、70 mg/L 5個(gè)濃度組，甲苯設(shè)70 、80、90 、100 、110 mg/L 5個(gè)濃度組；間二甲苯設(shè)40 、45 、50 、55 、60 mg/L 5個(gè)濃度組；對(duì)二甲苯設(shè)40 、45 、50 、55 、60 mg/L 5個(gè)濃度組；鄰二甲苯設(shè)40 、45 、50 、55 、60 mg/L 5個(gè)濃度組；苯設(shè)130 、140 、150 、160 、170 mg/L 5個(gè)濃度組；每個(gè)濃度組分別設(shè)置2個(gè)平行組，一個(gè)空白對(duì)照組[15]。試驗(yàn)期間使用未染毒的網(wǎng)兜在10 min內(nèi)將日本黃姑魚轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)玻璃鋼內(nèi)，試驗(yàn)周期為96 h。

試驗(yàn)期間不投餌、每24 h換水1/3。試驗(yàn)96 h內(nèi)連續(xù)觀察并記錄每組死亡數(shù)量、未死亡日本黃姑魚和瀕死日本黃姑魚的生理反應(yīng)并記錄日本黃姑魚的平均死亡情況。實(shí)驗(yàn)中，用玻璃棒觸碰日本黃姑魚尾部無任何反應(yīng)表示日本黃姑魚已完全死亡，及時(shí)將死亡的日本黃姑魚撈出。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和苯這6種石化工業(yè)特征污染物對(duì)日本黃姑魚的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，借助SPASS20.0建立不同觀察時(shí)段死亡概率單位-質(zhì)量濃度直線回歸方程，并采用直線內(nèi)插法分別計(jì)算的試驗(yàn)毒物在12 h、24 h、48 h和96 h的半致死濃度值(LC50)及96hLC5095 %置信區(qū)間。并采用安全濃度SC來計(jì)算各實(shí)驗(yàn)藥物的安全濃度。

公式：SC= 96hLC50×0.01[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 日本黃姑魚的中毒癥狀

日本黃姑魚從浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒養(yǎng)殖試驗(yàn)場運(yùn)回及時(shí)暫養(yǎng)在聚乙烯塑料缸(容積80 L)中。中途運(yùn)輸有部分黃姑魚由于高溫和缺氧死亡，及時(shí)撈出。暫養(yǎng)期間，日本黃姑魚喜歡呆在缸低，每日換水都能看出日本黃姑魚很活躍。換水時(shí)將死亡日本黃姑魚撈出，死亡數(shù)很少。試驗(yàn)時(shí)選取的是生命體征比較活躍的日本黃姑魚。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)日本黃姑魚不僅在石化特征污染物不同試驗(yàn)濃度下表現(xiàn)出不同的中毒癥狀，而且對(duì)不同污染物的耐受力也有明顯的差異。預(yù)試驗(yàn)階段，日本黃姑魚在低濃度組活動(dòng)的狀態(tài)和在空白對(duì)照組基本一致，在試驗(yàn)容器內(nèi)安靜的游動(dòng)，有聲響則表現(xiàn)出受驚狀態(tài)，游動(dòng)活躍。將日本黃姑魚放入高濃度組后日本黃姑魚會(huì)迅速表現(xiàn)的躁動(dòng)不安，與低濃度組的相比有很明顯的跳躍逃生的現(xiàn)象，高濃度組日本黃姑魚應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，無序游動(dòng)，并會(huì)很快死亡，浮在水面上。 隨著時(shí)間延長各實(shí)驗(yàn)濃度的日本黃姑魚死亡數(shù)量增多。日本黃姑魚中毒死亡整個(gè)過程表現(xiàn)為，反應(yīng)漸漸遲鈍、漂在水面上，極力掙扎后漂浮在水面上直至死亡。解剖可見體內(nèi)有明顯的充血中毒的癥狀。以上中毒癥狀與日本黃姑魚在硫酸銅溶液中的中毒表現(xiàn)相近[17]。

2.2 6種石化特征污染物對(duì)日本黃姑魚的急性毒性的劑量效應(yīng)

由(表1)可見6種石化工業(yè)特征污染物對(duì)日本黃姑魚的急性毒性效應(yīng)都隨著試驗(yàn)質(zhì)量濃度的提高和試驗(yàn)時(shí)間的延長表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)趨勢。但是可以看出不同試驗(yàn)的石化工業(yè)特征污染物(乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、苯)對(duì)日本黃姑魚的急性毒性影響有很大差距。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，較明顯的是毒性強(qiáng)度不同，乙基苯的毒性強(qiáng)度最大，96hLC5095% 置信區(qū)間[24.9～42.6]mg/L；間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯毒性強(qiáng)度接近，96hLC5095%置信區(qū)間分別為[33.0～47.0]mg/L、[27.6～45.7]mg/L、[31.3～47.2]mg/L；與乙基苯相比毒性強(qiáng)度稍弱一些；甲苯的96hLC5095%置信區(qū)間[58.0～83.0]mg/L ；相對(duì)乙基苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯來說，甲苯的毒性更弱一些；苯毒性強(qiáng)度最弱，96hLC5095%置信區(qū)間[122.2～146.0]mg/L ；這6種石化工業(yè)特征污染物的毒性強(qiáng)度大小為乙基苯>對(duì)二甲苯>鄰二甲苯>間二甲苯>甲苯>苯。

從試驗(yàn)不同時(shí)間下的平均死亡率看，日本黃姑魚開始死亡的時(shí)間也不同，實(shí)驗(yàn)開始的24 h內(nèi)，苯和鄰二甲苯?jīng)]有出死亡現(xiàn)象；試驗(yàn)開始在48 h 內(nèi)苯實(shí)驗(yàn)組最高濃度組的平均死亡率低于50 %，而其它毒物組最高濃度組的平均死亡率都等于或高于50 %；試驗(yàn)開始72 h內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組最高濃度組的平均死亡率都大于或等于80 %；實(shí)驗(yàn)開始在96 h內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組最高濃度組的平均死亡率都達(dá)到100%。

表1 不同時(shí)段6種石化工業(yè)特征污染物對(duì)日本黃姑魚的急性毒性

表1(續(xù))

2.3 6種石化特征污染物對(duì)日本黃姑魚安全質(zhì)量濃度評(píng)價(jià)

由(表2)可見，6種石化特征污染物相同觀察時(shí)段不同試驗(yàn)質(zhì)量濃度梯度組間的致死效果存在顯著差異，所建的死亡概率單位-質(zhì)量濃度回歸方程均顯示出較好地?cái)M合度和相關(guān)性(P<0.05)，表明日本黃姑魚的死亡率和毒物試驗(yàn)質(zhì)量濃度密切相關(guān)。

乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和苯對(duì)日本黃姑魚半致死質(zhì)量濃度96hLC50值依次為35.7 、75.7、43.1、41.5 、41.73 mg/L和138.4 mg/L(表2)。根據(jù)國家環(huán)保局相關(guān)文件規(guī)定，96hLC50>100 00 mg/L、100 0～100 00 mg/L、100～100 0 mg/L、1～100 mg/L、<1.0 mg/L分別為微毒、低毒、中毒、高毒、劇毒污[18]。按照這一等級(jí)的劃分，本實(shí)驗(yàn)中毒物乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和苯對(duì)日本黃姑魚毒性為高毒。其安全濃度分別為0.36 、0.76 、0.43 、0.41 、0.42 mg/L和1.38 mg/L。均高于《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-1989)》[19]規(guī)定的數(shù)值(石油類≤0.05 mg/L)，表明日本黃姑魚對(duì)這6種石化工業(yè)特征污染物具有較高的耐受性。6種石化工業(yè)特征污染物對(duì)日本黃姑魚毒性依次為乙基苯>對(duì)二甲苯>鄰二甲苯>間二甲苯>甲苯>苯。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，這6種石化工業(yè)特征污染物對(duì)日本黃姑魚均具有急性毒性。因此，在石化工業(yè)區(qū)應(yīng)該重視污水排放的管理，從源頭減少環(huán)境污染對(duì)海洋生物的危害。

表2 不同觀察時(shí)間段6種石化特征污染物對(duì)日本黃姑魚急性毒性特征分析

表2(續(xù))

2.4 日本黃姑魚96hLC50與KOW的關(guān)系

本章節(jié)試驗(yàn)以日本黃姑魚為受試生物，以半致死濃度評(píng)價(jià)了6種石化工業(yè)特征污染物(苯、甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、對(duì)二甲苯、乙基苯)對(duì)日本黃姑魚的急性毒性效應(yīng)。辛醇-水分配系數(shù)(KOW)為討論有機(jī)污染物在環(huán)境介質(zhì)(水、土壤或沉積物)中分配平衡的極其重要的參數(shù)。結(jié)合日本黃姑魚96hLC50與受試毒物KOW分析受試石化特征污染物對(duì)海洋生物的毒性效應(yīng)。日本黃姑魚96hLC50與受試毒物KOW的關(guān)系如(圖1)所示。從散點(diǎn)圖可以看出日本黃姑魚96hLC50與受試毒物KOW顯著相關(guān)，受試毒物KOW越大，日本黃姑魚96hLC50值越小，該毒物毒性越大。散點(diǎn)圖中有兩個(gè)點(diǎn)有偏離，說明還有其他因素影響受試毒物的毒性。

圖1 日本黃姑魚96hLC50與KOW的關(guān)系

3 結(jié)論

通過對(duì)日本黃姑魚的急性毒性試驗(yàn)，得出乙基苯、甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和苯對(duì)日本黃姑魚半致死質(zhì)量濃度96hLC50值依次為35.7 、75.7、43.1、41.5 、41.73 mg/L和138.4 mg/L；其安全濃度分別為0.36 、0.76 、0.43 、0.41 、0.42 mg/L和1.38 mg/L；毒性依次為乙基苯>對(duì)二甲苯>鄰二甲苯>間二甲苯>甲苯>苯；本實(shí)驗(yàn)受試毒物對(duì)日本黃姑魚毒性為高毒，且日本黃姑魚對(duì)受試毒物有較高的耐受性。日本黃姑魚96hLC50與受試毒物KOW呈顯著相關(guān)，受試毒物KOW越大，日本黃姑魚96hLC50值越小，該毒物毒性越大。