周九鵬 王英霞

1西安市胸科醫(yī)院（西安 710000）；2昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（昆明 650000）

膽管細胞癌（CCC）占胃腸道腫瘤的3%，在原發(fā)性肝癌中位列第二[1]，目前5年生存率仍不到5%[2]。因此，有必要尋找一種腫瘤標志物用于診斷CCC的預后，尋找可能的靶向治療。

同源異形盒D10（HOXD10）是HOX基因家族主要的調(diào)節(jié)基因的成員，直接調(diào)節(jié)器官形成和維持分化組織的功能。已證實多種腫瘤組織或細胞HOXD10表達水平明顯低于正常組織，如乳腺癌[3-4]、胃癌[5]、膠質(zhì)瘤[6]、肝細胞癌（HCC）[7]。惡性乳腺癌細胞HOXD10表達的恢復可明顯抑制細胞的遷移和增殖[3]。HOXD10表達丟失可增強乳腺癌的侵襲的能力[8]。然而HOXD10在CCC的表達及作用卻少有報道，本文旨在研究HOXD10在肝外膽管癌（ECC）組織中的表達及其預后意義。

1 對象與方法

1.1 患者及組織樣本該研究由西安市胸科醫(yī)院、昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會批準。本研究回顧了1998年11月至2013年11月在上述醫(yī)院接受手術治療的174例患者的數(shù)據(jù)資料。入選標準為：組織學證實的ECC的患者，確診時無遠處轉(zhuǎn)移，除皮膚癌外無惡性腫瘤史，排除術前和術后化療史及肝內(nèi)膽管癌和壺腹癌患者。

1.2 病理學評估所有病理切片均由兩位病理學專家評估，主要判斷腫瘤生長方式、組織學分化、病理切緣狀態(tài)、淋巴管浸潤情況、周圍神經(jīng)侵襲情況和淋巴結(jié)腫瘤狀態(tài)。所有患者根據(jù)第七版（AJCC）ECC的分期系統(tǒng)進行分期。

1.3 隨訪術后所有患者均接受常規(guī)臨床隨訪，包括術后每1～3個月進行CT掃描、肝功能檢查和糖類抗原 19?9（CA19?9）檢查。評估術后生存情況：隨訪至患者死亡或研究截止日期2015年12月10日。到研究結(jié)束時，119例（68.3%）患者死亡。

1.4 免疫組織化學染色與評估組織切片（4 μm）石蠟包埋，福爾馬林固定后進行免疫組織化學染色：HOXD10鼠抗人單克隆抗體（1∶800；abgent公司）。免疫組化染色采用SABC法（Vectastain Elite ABC 試劑盒，Vector Laboratories，Burlingame，CA）?？乖迯停何⒉t95℃ 15 min，冷卻95℃2 h，脫蠟切片用含3%過氧化氫的甲醇處理10 min。PBS清洗10 min后血清封閉?？笻OXD10單克隆抗體4℃孵育過夜。PBS清洗后，生物素標記的羊抗鼠二抗孵育10 min，之后過氧化物酶標記鏈霉親和素孵育10 min，DAPI顯色。蘇木精復染細胞核。常規(guī)應用免疫組化陽性和陰性對照。每個切片進行免疫反應評分基于免疫陽性細胞的比例（0：＜10%；1：≥ 10%～ ＜25%；2：≥ 25%～＜50%；3：≥50%～ ＜75%，4：≥75%）乘以染色強度（0：無著色；1：輕度；2：中度；3：強著色）。HOXD10表達水平分為4級：0：陰性；1～ 4：弱陽性；5～ 8：中度陽性；9～12：強陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法分類變量采用Pearson卡方檢驗，等級變量采用非參數(shù)檢驗進行比較。用Kaplan?Meier單因素分析法分析可能的預后因素，用Cox比例風險模型進行多因素分析。統(tǒng)計分析應用SPSS18.0軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXD10在ECC表達的免疫組化結(jié)果ECC組織HOXD10表達水平比正常癌旁組織明顯降低（P=0.001，圖1A）。HOXD10表達降低伴隨著腫瘤分化程度的降低（圖1B）。ECC組織的細胞核和細胞質(zhì)中均有HOXD10表達，與以前的研究相一致（圖1C、D、E）[9-10]。

圖1 HOXD10 CCC組織中與癌旁組織中的表達Fig.1 Expression of HOXD10 in CCC tissues and normal para?carcinoma tissues

2.2 HOXD10表達與ECC臨床病理特征相關性HOXD10高表達與ECC的低組織學分級（P＜0.001）和低的 T分期（P=0.002）明顯相關。HOXD10蛋白表達與其他臨床病理特征無顯著相關。見表1。

2.3 HOXD10表達對ECC的預后價值單因素生存分析示，與HOXD10表達陽性的患者相比，HOXD10陰性和陽性患者平均總生存期分別為14個月和23.7個月（P＜0.001，表2）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、組織學分級（P=0.018）、晚的臨床分期（P＜0.001）及手術切緣（P＜0.001）可顯著影響ECC患者的預后。Cox比例風險模型分析表明HOXD10蛋白表達陰性是總生存期的不良獨立預后因素（P=0.002，HR=1.830，表3）。

3 討論

本研究顯示，相比正常癌旁組織，HOXD10蛋白水平在ECC組織表達下調(diào)。這與之前乳腺癌[3-4]、胃癌[5]、肝癌[7]、結(jié)腸癌[11]、甲狀腺癌[12]和前列腺癌[13]中的研究一致。在這些腫瘤中，HOXD10已被證實抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[3-7]。相反的是，口腔鱗狀細胞癌HOXD10表達明顯高于正常口腔黏膜[14-15]。過度的HOXD10表達在頭頸部鱗癌細胞株表現(xiàn)為促進增殖、黏附和遷移[9]。HOXD10在人類腫瘤生長中也許有不同的作用。

圖2 單因素分析顯示，與HOXD10陰性表達的患者相比，HOXD10陽性表達的ECC患者有較長的總生存期（P＜0.001）Fig.2 The analysis with Kaplan?Meier method clearly showed that ECC patients having tumors with HOXD10 positive expression had increased overall survial compared with patients with negative HOXD10 expression（P ＜ 0.001）

表1 HOXD10表達與174例ECC臨床病理特征相關性Tab.1 Association of HOXD10 expression with the clinicopathological features of 174 patients with ECC 例

表2 ECC患者預后與各種臨床病理參數(shù)的單因素分析（n=174）Tab.2 Univariate analysis of the association between prognosis and various clinicopathologic parameters in patients with ECC

表3 ECC患者預后與各種臨床病理參數(shù)的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of the association between prognosis and various clinicopathologic parameters in patients with ECC

進一步的分析顯示，HOXD10蛋白表達與組織學分級、T分期有關。HOXD10表達水平隨著腫瘤分化程度的降低而降低（圖1B）。已有研究顯示HOXD10表達水平隨著乳腺腫瘤[16-17]、胃癌[18]和子宮內(nèi)膜癌[19]的組織學分化降低而降低，與本研究結(jié)果一致。WANG等[20]卻認為HOXD10表達與胃癌分化無關，與胃癌的T分期顯著相關。本研究并未發(fā)現(xiàn)HOXD10與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及AJCC分期相關。而有研究報道，轉(zhuǎn)移性胃癌組織較無轉(zhuǎn)移性者HOXD10顯著下調(diào)[18]。原因可能是本研究納入了更多的沒有遠處轉(zhuǎn)移的樣本。這表明局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移之間可能存在著不同的分子機制，有待進一步探討。

單因素分析顯示，HOXD10蛋白表達陽性的患者相比陰性預后較好（P＜0.001，圖2）。這與之前胃癌[5]結(jié)果相似。而HOXD10表達水平并沒有影響OSCC腫瘤的生存率[15]。HOXD10對于不同的腫瘤可能具有不同的功能。Cox比例風險回歸分析發(fā)現(xiàn)HOXD10陽性表達對ECC總生存期是一個獨立的預測因素，與YANG等[10]的研究一致。HOXD10表達也是胃癌[20]、前列腺癌[13]患者預后的獨立預測因素。這均表明HOXD10可作為ECC患者的獨立預后標志物。

在乳腺癌中，miR?10b[21]、miR?36b[22]下調(diào)HOXD10通過Akt信號通路促進細胞的侵襲。LIN等[23]發(fā)現(xiàn)胃癌中HOXD10啟動子甲基化率明顯增高。在HCC中，HOXD10的表達也受啟動子區(qū)甲基化的調(diào)控，通過抑制ERK信號傳導，抑制肝癌細胞的生長。miR?10b通過靶向HOXD10刺激RHOC的上調(diào)，促進結(jié)直腸癌的侵襲和遷移。另外，在甲狀腺癌中[12]，BRAF突變狀態(tài)與HOXD10甲基化和表達水平有關。HOXD10的作用機制已在其他腫瘤描述。HOXD10在ECC中抑制腫瘤的機制的尚不明確，今后需進一步的研究來闡明HOXD10對ECC的詳細作用機制。

總之，HOXD10蛋白在ECC中的表達比正常癌旁組織明顯下降，HOXD10蛋白的高表達與良性的臨床病理特征和較高的總生存期相關。因此，HOXD10可作為預測ECC惡性行為的一個指標。