方樂霞，郭宣宣，張 玲，曹 富，朱麗麗

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012)

中藥黃精為滇黃精(PolygonatumKingianumColl.et Hemsl.)、黃精(P.sibiricumRed.)或多花黃精(P.cyrtonemaHua)的干燥根莖，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之功效[1]。其中多花黃精和黃精為黃精藥材的主要來源。黃精屬于“藥食同源”的植物，不僅是常用的補益藥，也是一味重要的食療藥物?，F(xiàn)代研究表明，黃精含有多糖、皂苷、醌類、微量元素和多種對人體有用的氨基酸等成分，具有延緩衰老、降低血糖、免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗抑郁、改善記憶功能和防止阿爾茨海默病等作用[2-13]。其中氨基酸是黃精補益強壯作用和增強免疫功能的物質基礎之一，對維持生命活動有著非常重要的作用[14]。目前，黃精中氨基酸含量測定方法主要為采用柱前衍生高效液相色譜法及采用氨基酸自動分析儀對黃精中單一氨基酸含量進行測定[15-16]，尚未見關于黃精中總氨基酸含量測定的報道。筆者于2017年5月收集北京懷柔、安徽滁州、貴州貴陽、福建南平等19個產地的黃精新鮮根莖，采用2015年版《中華人民共和國藥典》“黃精”項下規(guī)定的加工方法加工成藥材，建立可見分光光度法測定不同產地黃精中總氨基酸含量，為黃精的綜合利用提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 756MC紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；BP211D電子天平(十萬分之一)：德國賽多利斯公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FW80高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 材料 L-精氨酸對照品(批號160821，純度≥98%)：成都普菲德生物技術有限公司；茚三酮：天津市光復科技發(fā)展有限公司；乙醇：上海潤捷化學試劑有限公司；磷酸等均為分析純：上海潤捷化學試劑有限公司；水為高純水。所有黃精樣品經安徽中醫(yī)藥大學王德群教授鑒定為黃精(PolygonatumsibiricumRed.)或多花黃精(P.cyrtonemaHua)的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取L-精氨酸對照品3.28 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配成濃度為0.131 2 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末(過三號篩)0.2 g，加入60%乙醇30 mL，超聲提取2次，每次45 min，濾過，合并濾液，減壓旋至無醇味，浸膏用水溶解，定容至50 mL。

2.3 測定波長的選擇 分別精密吸取L-精氨酸對照品溶液、供試品溶液各1.0 mL，置50 mL量瓶中，加茚三酮溶液1.0 mL(稱取茚三酮1.0 g加乙醇使溶解成50 mL，冷藏備用)和磷酸鹽緩沖液(pH為6.8)1.0 mL，搖勻，水浴加熱20 min，取出，冷卻，用水定容至刻度。以相應試劑為空白，在400～800 nm波長范圍內進行掃描，對照品溶液和供試品溶液在568 nm處均有最大吸收，因此，選擇測定波長為568 nm。結果見圖1。

注：1.對照品；2.供試品

2.4 顯色條件的考察

2.4.1 緩沖鹽溶液pH值考察 精密移取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中，加入pH值分別為5.2、6.0、6.8、7.6的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL和2%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，水浴加熱15 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL。以相應試劑為空白，于568 nm處測定吸光度(absorbance, A)。結果顯示使用pH值為6.8的磷酸緩沖鹽溶液所測得的吸光度最高。因此選擇緩沖鹽溶液pH值為6.8。

2.4.2 緩沖鹽溶液用量的考察 精密移取供試品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中，分別加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，各加入2.0%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，水浴加熱15 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL，測定A值。結果顯示磷酸鹽緩沖溶液用量為1.0 mL時吸光度最高。因此選擇磷酸鹽緩沖溶液用量為1.0 mL。

2.4.3 顯色劑用量的考察 精密移取供試品溶液1.0 mL置50 mL量瓶中，加入pH值為6.8的緩沖鹽溶液1.0 mL，分別加入2.0%茚三酮溶液0.5、1.0、1.5 mL，搖勻，水浴加熱15 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL，測定A值。結果顯示當顯色劑用量為1.0 mL時，吸光度最高。故選擇顯色劑用量為1.0 mL。

2.4.4 顯色時間的考察 精密量取1.0 mL供試液液于量瓶中，加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL、2%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，于沸水浴中分別加熱5、10、15、20、25 min，取出，冷卻，加水定容至50 mL，測定A值。結果顯示加熱時間為20 min時，A值最高，因此選擇顯色時間為20 min。

2.5 提取條件的考察

2.5.1 提取方式的考察 精密稱取樣品4份，每份約0.2 g，分別采用超聲提取、回流提取，濾過，合并濾液，濃縮回收乙醇，浸膏加水溶解，定容至50 mL。精密移取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中，以“2.3”項下方法顯色，測定A值。結果顯示超聲提取效果優(yōu)于回流提取。

2.5.2 提取時間的考察 精密稱取樣品3份，每份約0.2 g，采用超聲提取，超聲提取時間分別為30、45、60 min，按“2.5.1”項下自“濾過”起，依法操作，結果顯示提取45 min時A值最大。因此，選擇提取時間為45 min。

2.5.3 提取次數(shù)的考察 精密稱取樣品0.2 g，加60%乙醇30 mL超聲提取，提取次數(shù)分別為1、2、3次，按“2.5.1”項下自“濾過”起，依法操作，結果表明提取2次和3次時A值相近，為節(jié)約時間及能源，選擇提取次數(shù)為2次。

2.5.4 提取溶劑濃度的考察 精密稱取樣品4份，每份約0.2 g，分別加50%、55%、60%、70%乙醇30 mL，超聲提取2次，每次45 min，按“2.5.1”項下自“濾過”起，依法操作，結果顯示溶劑濃度為60%時A值最大。因此，選用60%的乙醇作為提取溶劑。

2.5.5 料液比考察 精密稱取樣品5份，每份約0.2 g，分別按料液比1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250加入60%乙醇進行超聲提取兩次，每次45 min。按“2.5.1”項下自“濾過”起，依法操作，結果表明料液比選取1∶150為佳。

2.6 方法學考察

2.6.1 標準曲線的繪制 精密吸取L-精氨酸對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別加2%茚三酮溶液1.0 mL和磷酸鹽緩沖液1.0 mL，水浴加熱20 min，取出，冷卻，用水定容至25 mL。以相應試劑為空白，在568 nm處測定A值，以對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標，A值為縱坐標，得回歸方程為A=0.084 3c-0.154 8(r=0.997 5)。表明L-精氨酸在3.248～18.368 μg/mL濃度范圍內與A值呈良好的線性關系。

2.6.2 精密度試驗 精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項下同法顯色，以相應試劑為空白，于568 nm處測定A值，重復測定6次，RSD=0.14%，結果表明該方法精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取同一批次藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項下同法顯色，測定A值，結果顯示總氨基酸含量RSD=0.20%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項下同法顯色，分別于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時測定A值，RSD=0.31%，結果表明該顯色反應在3 h內穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的黃精粉末0.1 g，平行9份，按1∶1.5、1∶1、1∶0.5分別加入精氨酸對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1.0 mL，按“2.3”項下同法顯色，在568 nm測定A值，計算加樣回收率，結果見表1。樣品平均加樣回收率為98.72%，RSD為1.26%，表明本法測定結果準確可靠。

表1 加樣回收率試驗

2.7 不同產地黃精中總氨基酸含量測定 取不同產地的黃精藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密移取供試品溶液1.0 mL，并按“2.3”項下方法顯色，在568 nm測定吸光度，樣品含量測定結果見表2。

3 討論

3.1 試驗條件討論

3.1.1 顯色條件考察結果 分別對不同磷酸緩沖液pH值、磷酸鹽緩沖液用量、顯色劑用量、顯色時間進行考察，最終確定黃精中總氨基酸含量測定的最佳顯色條件為：加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，2%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，于沸水浴中加熱20 min。

3.1.2 提取條件考察結果 分別考察了提取方式(超聲提取，回流提取)、不同提取時間、提取次數(shù)、提取溶劑濃度、料液比。確定用于黃精中總氨基酸含量測定的供試品溶液的最佳提取工藝為：取黃精粉末0.2 g，精密稱定，加入60%乙醇30 mL，超聲提取2次，每次45 min。

表2 黃精樣品來源和總氨基酸含量

3.2 實驗結果討論

3.2.1 多花黃精中總氨基酸含量與黃精中總氨基酸含量結果分析 5個產地黃精總氨基酸含量范圍在5.79%～9.93%，平均值為7.83%。如以-20%為下限，建議黃精總氨基酸含量應不低于6.26%。5個產地的黃精基本達到該含量。14個產地多花黃精總氨基酸含量范圍在2.94%～6.97%，平均值為5.10%。由于產地不同，各品種的多花黃精中總氨基酸含量有所差異。如以-20%為下限，建議多花黃精總氨基酸含量應不低于4.08%。含量結果顯示黃精中總氨基酸含量明顯高于多花黃精。

3.2.2 不同產地多花黃精中總氨基酸含量比較 14個產地多花黃精總氨基酸含量在其分布的東、西、北緣較高；從四川盆地到浙、閩丘陵到貴州、湖南山區(qū)，總氨基酸含量呈增大趨勢。貴州遵義、江西撫州、福建南平、湖南岳陽多花黃精總氨基酸含量較高，因其經度相似，均屬于亞熱帶溫潤季風區(qū)，降水豐富，利于氨基酸成分的積累。金寨(葉背面有毛型)、金寨(葉梗長型)、浙江杭州、四川資陽含量較低。安徽青陽多花黃精總氨基酸含量明顯高于安徽金寨，因青陽既有亞熱帶濕潤季風氣候的總體特征，又有受山區(qū)海拔高度、地形地勢影響而形成的陰、涼、濕的山區(qū)氣候特點。四川資陽多花黃精總氨基酸含量最低，可能是由于其處于盆地，常年有霧，日照不足，不利于氨基酸成分的積累。

3.2.3 不同產地黃精中總氨基酸含量比較 黃精產地分布與總氨基酸含量呈現(xiàn)出由西向東逐漸下降的趨勢。陜西商洛由于受到冬夏季風和青藏高原環(huán)流的影響，加之秦嶺整個山脈對南方暖濕氣流的阻擋作用，造成其四季分明，雨熱同期的氣候特點，這可能是造成商洛黃精中氨基酸含量較高的原因。

本研究采用可見分光光度法建立了黃精中總氨基酸含量的測定方法，該方法操作簡便、快速，結果準確，可作為黃精中總氨基酸含量的測定方法。本研究對黃精中總氨基酸含量進行測定，對于黃精的綜合利用具有一定的意義。

(在樣品的收集過程中得到安徽森灃綜合開發(fā)有限公司的幫助，樣品的加工得到安徽中醫(yī)藥大學2015級研究生彭星星、劉校的幫助，在此表示感謝！)