董兆旻，謝先梅，孫 穎，戴 敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，安徽 合肥 230012)

高脂血癥是指生物體內(nèi)脂質(zhì)代謝失常，是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生的主要誘因和早期病變。肝臟是脂質(zhì)代謝的主要器官，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是脂質(zhì)代謝關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)者，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝可促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出，減少脂質(zhì)積累，防止泡沫細(xì)胞形成，抑制AS的形成[1]。自噬是細(xì)胞對外界環(huán)境壓力變化的一種反應(yīng)，是在自噬相關(guān)基因調(diào)控下通過溶酶體來降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過程，并能為細(xì)胞提供自我更新的營養(yǎng)及材料，使其能在饑餓和各種應(yīng)激環(huán)境下維持自身穩(wěn)態(tài)[2-3]。自噬在AS發(fā)生發(fā)展的不同階段可能發(fā)揮著重要的作用[4]，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ型(microtubule-associated protein 1 light 3, type 2，LC3Ⅱ)、p62表達(dá)水平可作為衡量自噬水平的重要指征。然而在AS發(fā)病前期肝臟脂質(zhì)代謝紊亂時自噬處于何種狀態(tài)目前尚未見報道。丹皮酚(paeonol，Pae)是從毛茛科植物牡丹(PaeoniaSuffruticoasAndr.)的干燥根皮中提取的主要活性成分之一，具有調(diào)脂和抗AS作用[5-7]，還能調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達(dá)[8]。至今還沒有研究證實Pae對高脂狀態(tài)下肝臟自噬水平的影響。本研究探索Pae對高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)代謝及自噬的影響，為進(jìn)一步揭示Pae抗AS早期病變的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 Pae(純度99%，批號 20170306)：安徽省宣城百草植物工貿(mào)有限公司；雷帕鳴(含雷帕霉素1 mg，批號 S70704)：美國惠氏制藥；立普妥(含阿托伐他汀片10 mg，批號 S87401)：美國惠氏制藥；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)：上海試劑一廠；維生素D2注射液(批號 16112601)：江西贛南海欣藥業(yè)股份有限公司；LC3抗體(ab128025)、PPARγ抗體(ab209350)、p62抗體(ab56416)：美國Abcam公司。

1.2 實驗動物 SPF級7～8周齡雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±20)g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[動物使用許可證號：SCXK(皖)2017-001]，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物房中，在溫度20～24 ℃，相對濕度45%～65%，光照/黑暗周期為12 h/12 h的條件下飼養(yǎng)，動物實驗設(shè)計征得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會同意。

1.3 主要儀器 CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡：德國Leica公司；H-7650透射電子顯微鏡：日本Hitachi公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 將56只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)均分7組(每組8只)：正常對照組，模型組，Pae高、中、低劑量組，雷帕霉素組，阿托伐他汀組。在模型復(fù)制同時，正常對照組和模型組給予等容量0.5% CMC-Na，Pae高、中、低劑量組分別給予含Pae 300、150、75 mg/kg的0.5% CMC-Na，雷帕霉素組給予含雷帕霉素0.2 mg/kg的0.5% CMC-Na，阿托伐他汀組給予含阿托伐他汀5 mg/kg的0.5% CMC-Na。灌胃容積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)6周。

2.2 模型復(fù)制 正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料(3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油，81.3%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，除正常對照組外，在高脂飼料喂養(yǎng)前，其余各組大鼠一次性腹腔注射維生素D260萬U/kg。每周稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，所有動物自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)6周。

2.3 脂質(zhì)水平檢測 大鼠禁食不禁水12 h后，稱質(zhì)量，采用3.5%水合氯醛生理鹽水溶液10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈分叉處取血，3 000 r/min離心10 min，得血清，備用。取大鼠肝右葉尖同一部位，準(zhǔn)確稱取0.2 g，按1∶9[質(zhì)量(g)∶體積(mL)]的比例，加入9倍的無水乙醇1.8 mL，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液。將血清及肝勻漿上清液通過全自動生化分析儀測定血清及肝臟的總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)水平。

2.4 肝系數(shù)水平的檢測 動物處死后，取肝臟，置冰冷的生理鹽水中反復(fù)沖洗，剔除脂肪及結(jié)締組織。濾紙吸干表面水分后準(zhǔn)確稱質(zhì)量，計算肝質(zhì)量系數(shù)(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)。

2.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)積分標(biāo)準(zhǔn) 取肝臟左葉尖同一部位，用10%中性甲醛固定，組織標(biāo)本脫水，常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片，切片厚度3 μm。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察主動脈組織病理改變。計算機(jī)病理圖像分析軟件測定，對結(jié)果進(jìn)行量化。①肝臟脂肪變性程度評分：根據(jù)脂肪變性累計體積占肝組織體積百分比劃分等級并計分，<5%，計0分；5%～33%，計1分；>33%，且≤66%，計2分；>66%，計3分。

2.6 電鏡下觀察肝臟自噬小體 每組隨機(jī)抽取3只大鼠，取大鼠肝左葉同一部位，切成1 mm3左右，迅速固定于2.5%戊二醛中，置4 ℃冰箱，充分固定后，用0.1 mol/L磷酸緩沖液充分清洗，1%鋨酸中固定1 h。再按50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、90%丙酮、90%丙酮、100%丙酮的順序進(jìn)行梯度脫水，每梯度脫水2次，每次5 min。純環(huán)氧樹脂包埋劑包理，超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾、枸櫞鉛雙重染色，各10 min，透射電鏡下觀察各組大鼠肝細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)及其包裹物質(zhì)，拍照記錄。

2.7 免疫組織化學(xué)法檢測肝臟PPARγ、LC3Ⅱ、p62表達(dá)水平 采用免疫組織化學(xué)二步法檢測肝臟PPARγ、LC3Ⅱ、p62的表達(dá)水平，于顯微鏡下觀察，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對陽性率(總陽性面積/圖片總面積×100%)進(jìn)行量化。

3 結(jié)果

3.1 Pae對高脂血癥大鼠血清和肝臟脂質(zhì)水平及肝系數(shù)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清和肝臟中TG、TC水平和肝系數(shù)均顯著增加(P<0.05)，提示大鼠高脂血癥模型復(fù)制成功。Pae高、中、低劑量組大鼠血清和肝臟中TG、TC水平和肝系數(shù)呈劑量依賴性地降低，與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示Pae具有改善血脂紊亂的作用。見表1。

表1 Pae對高脂血癥大鼠脂質(zhì)水平及肝系數(shù)的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 Pae對高脂血癥大鼠肝臟組織形態(tài)的影響 HE染色顯示，正常對照組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)排列正常，肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整，中央有核，胞質(zhì)均勻，無脂滴；模型組大鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡樣變性，為重度肝細(xì)胞變性；各給藥組大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性程度減輕，脂滴數(shù)量減少，有一定程度的改善。定量分析結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟脂肪變性評分(2.75±0.50)較正常對照組(0.25±0.50)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Pae低、中、高劑量組和阿托伐他汀組大鼠肝臟脂肪變性評分分別為(2.00±0.00)、(1.50±0.58)、(1.25±0.50)、(1.25±0.50)，較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注:A.正常對照組;B.模型組;C.阿托伐他汀組;D. Pae低劑量組;E. Pae中劑量組;F. Pae高劑量組圖1 Pae對高脂血癥大鼠肝臟脂肪病變的影響(HE染色,10×40倍,n=8)

3.3 電鏡下各組高脂血癥大鼠肝臟組織自噬小體變化比較 正常對照組肝臟細(xì)胞質(zhì)中未見自噬小體；模型組肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見大量脂質(zhì)體，可見少量自噬體及被包裹的降解物；Pae低、中、高劑量組肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見較多的自噬體及被包裹的降解物，脂滴的數(shù)量較模型組減少，且隨Pae劑量增加，自噬體數(shù)量逐漸增加；雷帕霉素組肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見較多的自噬體及被包裹的降解物。見圖2。

3.4 Pae對大鼠肝臟PPARγ、LC3Ⅱ、P62表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟LC3Ⅱ表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)，p62和PPAR-γ表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。與模型組相比較，Pae高、中、低劑量組，雷帕霉素組LC3Ⅱ表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，p62表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Pae對大鼠肝臟LC3Ⅱ和p62的效應(yīng)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；Pae中、高劑量組和阿托伐他汀組PPAR-γ表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。見圖3、圖4。

注:A.正常對照組;B.模型組;C.雷帕霉素組;D. Pae低劑量組;E. Pae中劑量組;F. Pae高劑量組圖2 電鏡下各組大鼠肝臟組織自噬小體變化比較(×4 000倍)

4 討論

高脂血癥是一種臨床常見而多發(fā)的代謝性疾病，是因生物體內(nèi)脂代謝異常導(dǎo)致血漿內(nèi)脂質(zhì)濃度高于正常水平的一種疾病，是導(dǎo)致動脈粥樣硬化、冠心病等重要危險因素之一。本研究中，采用大劑量腹腔注射維生素D2與高脂飼料喂養(yǎng)后大鼠血脂和肝脂水平明顯升高，結(jié)合對高脂大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)果的分析，均表明高脂模型復(fù)制成功。脂質(zhì)水平檢測結(jié)果顯示，Pae通過降低血漿及肝臟中TC、TG達(dá)到干預(yù)高脂血癥病變發(fā)展的作用，同時肝系數(shù)的比較結(jié)果也提示Pae具有抑制高脂血癥病變發(fā)展的作用。PPARγ是脂質(zhì)代謝關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，同時具有調(diào)節(jié)血脂等作用，可作為衡量脂質(zhì)代謝水平的標(biāo)志因子。本研究結(jié)果顯示，Pae可提高PPARγ的表達(dá)水平，且與阿托伐他汀組無明顯差異。說明Pae對高脂大鼠肝臟脂質(zhì)代謝具有促進(jìn)作用。

圖3 各組大鼠肝臟LC3Ⅱ、P62、PPARγ表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)染色法，10×40倍)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

脂質(zhì)代謝紊亂是高脂血癥發(fā)生的根本原因，一般情況下脂質(zhì)代謝有兩種途徑：一是通過胞質(zhì)中性化水解酶降解脂質(zhì)進(jìn)行的；二是通過自噬溶酶體降解脂質(zhì)進(jìn)行的[9]，該途徑與自噬相關(guān)。近年來有不少研究顯示，自噬與脂質(zhì)代謝的關(guān)系是相互作用的，抑制自噬會阻礙脂質(zhì)代謝，使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加[10-11]；同時細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加會反向調(diào)節(jié)自噬，使自噬受到抑制，這種相互關(guān)系可能會使細(xì)胞陷入惡性循環(huán)，抑制自噬會促進(jìn)脂質(zhì)積累，進(jìn)而進(jìn)一步抑制自噬功能，從而增加脂質(zhì)積累，最終導(dǎo)致高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病。本研究采用電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)Pae組大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見較多的自噬體及被包裹的降解物，脂滴的數(shù)量較模型組減少，且隨Pae劑量增加，自噬體數(shù)量依次增加，表明Pae促進(jìn)脂質(zhì)代謝的同時伴隨自噬發(fā)生，且自噬程度隨Pae劑量增加而提升。LC3Ⅱ是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，可作為自噬發(fā)生的分子標(biāo)志物，而p62是一種多功能蛋白，既是連接自噬體與泛素化標(biāo)記蛋白質(zhì)聚合體的橋梁，同時也是自噬過程的選擇性底物，可作為自噬能力的指征[12-13]。為了進(jìn)一步研究Pae與自噬和脂質(zhì)代謝的關(guān)系，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測各組LC3Ⅱ、P62的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Pae可促進(jìn)LC3Ⅱ表達(dá)，抑制p62表達(dá)，且與雷帕霉素組無顯著性差異。說明Pae可激活自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ、p62的表達(dá)。

本研究在建立高脂血癥模型基礎(chǔ)上，探討Pae對脂質(zhì)代謝和自噬均有明顯的調(diào)節(jié)作用，然而尚不清楚Pae的調(diào)節(jié)血脂作用與自噬的關(guān)系，本課題組將在后續(xù)研究中作更深入的探討。