黃小林， 楊育凱， 林黑著， 李 濤， 虞 為， 黃 忠

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 深圳試驗(yàn)基地， 深圳 518121; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510300)

籃子魚屬(Siganus)在分類上隸屬于鱸形目(Perciformes)刺尾魚亞目(Acanthuroidei )籃子魚科(Siganidae)[1]，該屬魚類為小型淺海魚類，棲息于近岸巖礁海域，廣泛分布于太平洋、印度洋熱帶亞熱帶海域，在中國(guó)的南海、東海和臺(tái)灣海域均有分布。該屬魚類共27種，在中國(guó)累積記錄有13種[2-3]?；@子魚肉嫩味美，富含高不飽和脂肪酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛。食性雜食偏植食性，喜刮取附著在礁石或網(wǎng)衣上的藻類為食，具有飼料來源易解決、養(yǎng)殖成本較低、大小均可出售、飼養(yǎng)周期短、網(wǎng)箱套養(yǎng)還能清潔網(wǎng)衣等諸多優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)潛力大，已逐漸成為新的海水養(yǎng)殖對(duì)象[3]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)籃子魚的系統(tǒng)進(jìn)化研究不多，屬內(nèi)部分種間形態(tài)差異不明顯，物種不易鑒定，馬強(qiáng)等[4]通過檢視標(biāo)本和查閱文獻(xiàn)，確定目前在中國(guó)海域分布有籃子魚11種，并依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，比較分析了籃子魚體形、體色、牙齒、頭骨、椎骨、耳石等特征方面的種間差異。Kuriiwa等[5]通過線粒體基因Cytb和核基因ITS1對(duì)19種籃子魚進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，褐籃子魚與長(zhǎng)鰭籃子魚合為一支，狐籃子魚與尖嘴籃子魚合為一支，且在這兩個(gè)分支中彼此分布相互嵌套，這與上述兩對(duì)籃子魚在形態(tài)上較難區(qū)分是吻合的。

mtDNA作為重要的核外遺傳物質(zhì)，因其基因組成簡(jiǎn)單、進(jìn)化快、嚴(yán)格的母系遺傳等優(yōu)勢(shì)，已被廣大學(xué)者用于系統(tǒng)進(jìn)化研究[6-14]。本文全面分析了籃子魚線粒體基因組結(jié)構(gòu)和變異位點(diǎn)，檢測(cè)了進(jìn)化過程中蛋白質(zhì)編碼基因受到的選擇壓力，分析了不同基因在系統(tǒng)發(fā)育分析中的適用性，并找出合適的分子標(biāo)記。本研究旨在為籃子魚系統(tǒng)分類和資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因組結(jié)構(gòu)和堿基差異性分析

從NCBI下載6種籃子魚mtDNA全序列和2條相近屬(刺尾魚屬)白胸刺尾魚(Acanthurus.leucosternon)和縱帶刺尾魚(A.lineatus)[5]的mtDNA全序列(表1)。檢索并統(tǒng)計(jì)每種籃子魚mtDNA序列的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)；在Clustal W[15]軟件中比對(duì)并輔以人工校對(duì)，用軟件Mega 5.0分析各基因的堿基含量，通過軟件DnaSP 5.10分析各基因的變異位點(diǎn)等[16]。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

以白胸刺尾魚和縱帶刺尾魚作為外群，用Mega 5.0軟件中的鄰接法 (NJ)構(gòu)建6種籃子魚線粒體基因組全序列、蛋白質(zhì)編碼基因及合并序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Bootstrap法(重復(fù)1000次)檢驗(yàn)各分支的置信度。

1.3 Ka/Ks分析與中性檢驗(yàn)

物種進(jìn)化速率由穩(wěn)定性(負(fù))選擇、定向(正)選擇和突變決定[9-13]。為檢驗(yàn)籃子魚mtDNA各基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力，通過軟件DnaSP 5.10計(jì)算獲得每個(gè)蛋白編碼基因的非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)，并進(jìn)行Tajima′s D中性檢驗(yàn)。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育信息分析

參照黃小林[11-13]等的方法，用Mega 5.0中的鄰接法(K2P Model)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(NJ樹)。通過NJ樹中各分支Bootstrap的置信度大小來判斷各分支的可靠性，從而評(píng)估m(xù)tDNA中不同基因?qū)@子魚屬系統(tǒng)進(jìn)化分析的適用性，計(jì)算由單個(gè)基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹各分支的置信度和與堿基信息量(置信度和/序列長(zhǎng)度)，將蛋白質(zhì)編碼基因合并序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹定為標(biāo)準(zhǔn)樹供比對(duì)，用于比較分析mtDNA中不同基因在系統(tǒng)進(jìn)化分析中的適用性。

2 結(jié)果

2.1 線粒體基因組結(jié)構(gòu)特征

mtDNA全長(zhǎng)16 491～16 505 bp(表1)，結(jié)構(gòu)和排列順序與其他硬骨魚類一致[18-19](圖1)，包含蛋白質(zhì)編碼基因13個(gè)、rRNA基因2個(gè)、tRNA基因22個(gè)和D-loop，排列緊湊，無內(nèi)含子。

表1 籃子魚線粒體基因組基本信息

圖1籃子魚線粒體基因組結(jié)構(gòu)

除ND4L外，mtDNA堿基組成上均出現(xiàn)明顯的反G偏倚，各基因的變異位點(diǎn)分析(表2)，其中，12S rRNA和16S rRNA基因最保守，變異位點(diǎn)比例分別為4.01%和6.91%，其次為COX2(12.01%)和ATP8(14.29%)，最高的是ND3基因(22.77%)。

2.2Ka/Ks分析及Tajima′s D中性檢驗(yàn)

13個(gè)蛋白編碼基因的Ka/Ks[18]比值(表3、圖2)，所有蛋白編碼基因Ka/Ks均遠(yuǎn)小于1(0.015～0.62)，表明在進(jìn)化過程中籃子魚線粒體13個(gè)蛋白編碼基因受到穩(wěn)定性(負(fù))選擇作用較強(qiáng)；Tajima′s D檢驗(yàn)[19]結(jié)果與Ka/Ks分析一致(Tajima′sD=0.123 74～0.615 14，P>0.10)?；@子魚線粒體13個(gè)蛋白編碼基因中，ATP8的Ka/Ks最大(0.064)，表明該基因在進(jìn)化過程中受到的穩(wěn)定性(負(fù))選擇壓力較小，之后是ND2和ND6(0.063和0.062)。反之，Cox1和ND4L基因的Ka/Ks最小(分別是0.015和0.021)，表明這兩個(gè)基因在進(jìn)化過程中受到的穩(wěn)定性(負(fù))選擇壓力較大。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

mtDNA及蛋白編碼基因合并序列的NJ樹(圖3和圖4)，全序列與蛋白質(zhì)編碼基因合并序列所構(gòu)建的NJ樹聚類關(guān)系一致。作為外類群的白胸刺尾魚和縱帶刺尾魚位于樹的底部?；@子魚分子系統(tǒng)樹結(jié)構(gòu)：尖嘴籃子魚與狐籃子魚最先聚成一支，再依次與眼帶籃子魚和點(diǎn)籃子魚聚類，之后與褐籃子魚和長(zhǎng)鰭籃子魚聚成的一支聚類。尖嘴籃子魚與狐籃子魚的親緣關(guān)系較近，褐籃子魚和長(zhǎng)鰭籃子魚親緣關(guān)系較近。

表2 籃子魚mtDNA及不同區(qū)域的序列長(zhǎng)度、G+C含量(%)、變異位點(diǎn)數(shù)(%)置信度和(N)及評(píng)價(jià)

注：表中P(poor)差；M(middle)中等；G(good)好；VG(very good)很好

表3 籃子魚屬線粒體蛋白質(zhì)編碼序列Ka/Ks分析及Tajima′s D中性檢驗(yàn)

2.4 系統(tǒng)發(fā)育信息分析

mtDNA全序列、蛋白編碼基因合并序列及單基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度及每個(gè)堿基的平均信息量(表2)。mtDNA全序列和蛋白編碼基因合并序列的置信度和最高(N=400)，高于各單基因序列，但其單堿基信息量(分別為0.03和0.04)低于所有單基因序列。單基因序列中，置信度和最高的是ND4和ND5基因(N=399)，其次是COX1、Cytb和12S rRNA基因(N=398)，單堿基信息量最大的是ATP8基因(N/L=2.51)。

圖2 蛋白質(zhì)編碼基因Ka/Ks分析

圖3 線粒體基因組全序列 NJ 樹

圖4 蛋白編碼基因合并序列 NJ 樹

對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)樹(圖4)發(fā)現(xiàn)，除ND4L基因系統(tǒng)樹(圖5)中物種聚類關(guān)系存在差異外，其余基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹(未列出)與標(biāo)準(zhǔn)樹物種聚類關(guān)系一致。

圖5 基于ND4L基因的 NJ 樹

3 討論

蛋白編碼基因中堿基的非同義突變?cè)斐赊D(zhuǎn)錄的氨基酸不同，導(dǎo)致蛋白質(zhì)原有功能發(fā)生改變，在進(jìn)化過程中，這部分突變被視為有害突變而被穩(wěn)定性(負(fù))選擇所修復(fù)；同義突變不造成氨基酸改變，被認(rèn)為是中性或近中性的而被隨機(jī)遺傳漂變所固定。因此，體現(xiàn)出來的差異是非同義替換率小于同義替換率(KaKs，則認(rèn)為非同義突變有利于物種適應(yīng)環(huán)境而被定向(正)選擇所固定。同理，當(dāng)Ka=Ks[8-12]時(shí)，表明全部突變?yōu)橹行曰蚪行?，不受任何選擇作用影響。

本文研究的籃子魚線粒體基因組中，所有蛋白編碼基因的Ka/Ks(表3，圖2)均遠(yuǎn)小于1，且Tajima′sD=0.123 74～0.615 14(P>0.10)均不顯著大于或小于0，表明籃子魚線粒體基因組蛋白編碼基因進(jìn)化過程中均受到較強(qiáng)的穩(wěn)定性(負(fù))選擇作用。這與短尾派(Brachyura)[20]、中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[21]、金線鲃(Sinocyclocheilusgraham)[22]等物種的線粒體基因組研究結(jié)論一致。ATP8基因的Ka/Ks最大，這在之前的研究中多有報(bào)道，其中海膽綱[26]線粒體基因組時(shí)發(fā)現(xiàn)ATP8基因Ka/Ks大于1，存在定向(正)選擇。而鳀科魚類[13]線粒體全基因組研究發(fā)現(xiàn)ND6基因Ka/Ks(1.139)大于1，存在定向(正)選擇，這現(xiàn)象在魚類mtDNA中極少出現(xiàn)，值得進(jìn)一步研究，或許與在計(jì)算ND6基因Ka和Ks值時(shí)未將序列反向有關(guān)，因?yàn)樵趍tDNA結(jié)構(gòu)中，8個(gè)tRNA和ND6在輕鏈上編碼，其余基因都由重鏈編碼，重鏈和輕鏈上的復(fù)制方向相反，因此在計(jì)算ND6基因的Ka和Ks值時(shí)，應(yīng)先將序列反向。

在NJ樹中，褐籃子魚和長(zhǎng)鰭籃子魚位于系統(tǒng)樹根部位置，是本研究6種籃子魚中最早演化出來的一枝，之后相繼分化出點(diǎn)籃子魚、眼帶籃子魚、狐籃子魚和尖嘴籃子魚，這種進(jìn)化順序與這幾種籃子魚的體色變化是一致的，從褐籃子魚和長(zhǎng)鰭籃子魚的棕褐色→點(diǎn)籃子魚的淡藍(lán)綠色→眼帶籃子魚的黃色至橙黃色→狐籃子魚和尖嘴籃子魚的鮮黃色，體色變化越來越艷麗，表明籃子魚屬魚類體色在進(jìn)化過程起到了一定的正向選擇作用，值得進(jìn)一步研究。

系統(tǒng)發(fā)育信息分析中，ATP8和ND3基因雖然有較高的單堿基信息量，但置信度和較低，不宜選為理想分子標(biāo)記。綜合表2中分析數(shù)據(jù)，籃子魚mtDNA各基因用于種群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析的適用性順序：COX1、ND4和Cytb最好，其次是ND5、16SrRNA、ND2和ATP6，ATP8、ND4L和12SrRNA較差，其余基因表現(xiàn)中等。mtDNA中不同基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力不同，進(jìn)化速率也不同，導(dǎo)致各基因所包含的系統(tǒng)發(fā)育信息有所差異[18]。黃小林等[11]、張麗麗等[13]、郭昱嵩等[25]、陳姝君等[24]和Zardoya等[23]分別基于石斑魚屬、鳀科、鱸形目、硬骨魚類和脊椎動(dòng)物等不同分類階元評(píng)估線粒體蛋白質(zhì)編碼基因在系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)的適用性。本文在總體上與前人結(jié)論一致，但在個(gè)別基因上存在差異，作者認(rèn)為這與研究對(duì)象和分類階元不同有關(guān)，存在一定的物種和階元差異性。通過與同階元及不同階元的比較揭示了籃子魚屬mtDNA中不同基因進(jìn)化的規(guī)律，為后續(xù)籃子魚的系統(tǒng)分類研究和分子標(biāo)記的選取提供參考和依據(jù)。