孫黃兵, 鐘年孝, 孔令茹, 丁婷, 馬元山

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院， 合肥 230036； 2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)園管理中心， 合肥 230036)

玉米小斑病(Bipolarismaydis)是玉米常見的重要病害之一，主要危害玉米的苞葉和葉片，嚴(yán)重時(shí)則會導(dǎo)致果穗下垂掉落，可導(dǎo)致玉米產(chǎn)量減少一半以上[1-3]。目前，對玉米小斑病的防治常采用化學(xué)防治，但化學(xué)藥劑的長期使用，在導(dǎo)致植物病原菌產(chǎn)生抗藥性，降低藥效的同時(shí)，還存在對環(huán)境的污染，對人類健康以及生態(tài)平衡的危害。生物防治以其無毒無污染、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中受到了越來越多的關(guān)注。目前，用于植物病害生物防治的微生物種類主要有真菌、細(xì)菌以及放線菌。

研究表明水楊酸(Salieylicaeid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和乙烯(Ethylene，ET)在植物防衛(wèi)中可作為內(nèi)源信號，介導(dǎo)植物形成相應(yīng)的水楊酸、茉莉酸和乙烯信號通路，繼而引發(fā)植物的抗病性。植物防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制主要有2種類型：由病原微生物等誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)和由非病原性微生物介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)[4]。SAR主要通過內(nèi)源水楊酸的合成和積累，激活SA信號通路，誘導(dǎo)效應(yīng)基因PRS表達(dá)；而ISR的信號傳導(dǎo)主要依賴于感應(yīng)植物激素茉莉酸和乙烯[5-6]。目前，大量研究主要集中于根圍促生菌對植物抗病性的誘導(dǎo)方面，而對拮抗內(nèi)生菌引入植株，誘導(dǎo)其抗病性機(jī)制方面的報(bào)道相對較少。本課題組前期自杜仲植物中分離到的一株內(nèi)生枯草芽孢桿菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)，對玉米小斑病表現(xiàn)出良好的抗病效果，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜顯示菌株DZSY21可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)[7]。因此，本試驗(yàn)將杜仲拮抗內(nèi)生細(xì)菌DZSY21引入玉米植株，檢測玉米相關(guān)防御酶活性、抗病相關(guān)信號通路標(biāo)志基因表達(dá)情況，以期進(jìn)一步明確DZSY21菌株誘導(dǎo)玉米植株抗小斑病的作用機(jī)理，對于全面了解拮抗內(nèi)生菌與植物抗病機(jī)制之間的關(guān)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

生防菌株為前期研究中獲得的一株離體條件下對玉米小斑病以及玉米紋枯病菌具有較好抑菌活性的杜仲內(nèi)生細(xì)菌，編號為DZSY21 (BacillussubtilisDZSY21)，NCBI登錄號為KP777560，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號: CGMCC NO. 11749)。玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)教研室提供。

1.2 供試玉米品種

玉米自交系昌7-2。

1.3 供試培養(yǎng)基和化學(xué)藥劑

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)[8]和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(NA)[9]分別用于玉米小斑病菌及杜仲內(nèi)生細(xì)菌DZSY21的培養(yǎng)及保存。

50%多菌靈可濕性粉劑(青島瀚正益農(nóng)生物科技有限公司)：用無菌水配成50 μg/mL溶液，貯藏備用。

1.4 DZSY21菌懸液制備

菌株DZSY21接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，于37℃培養(yǎng)8 ～ 10 h，調(diào)節(jié)發(fā)酵液中DZSY21的菌體濃度至1.0×106cfu/mL，獲得DZSY21菌懸液。

1.5 玉米小斑孢子懸浮液制備

將培養(yǎng)好的玉米小斑病菌接種在玉米粒培養(yǎng)基上，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱4～5 d，取出用紗布洗去表面的營養(yǎng)菌絲，然后平鋪在托盤上，在紫外燈下照射60 min，取出，放在室溫保濕培養(yǎng)2～3 d，用滅過菌的水清洗帶有玉米小斑病菌的玉米粒，用血球計(jì)數(shù)板測定孢子濃度。

1.6 生防菌DZSY21引入玉米植株對玉米植株酶活性的影響

將玉米種子(昌7-2) 依次用1%的次氯酸鈉表面消毒10 min，用無菌水沖洗3～5遍后備用。實(shí)驗(yàn)田設(shè)于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地農(nóng)萃園(土壤為黃棕壤土)中，種植方式為壟栽種植，壟面寬 70 cm，壟距 30 cm，株距 30 cm，行距 60 cm，待玉米均長至抽雄期，選擇長勢相當(dāng)?shù)挠衩捉】抵仓?，將濃度?.0 ×106cfu/mL DZSY21菌懸液噴灑在玉米植株的葉片上(50 mL/株)，培養(yǎng)24 h后，于相同部位接種含菌量為1.0×106cfu/mL的玉米小斑病菌分生孢子懸浮液(50 mL/株)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下4種處理：1)在玉米葉片上先進(jìn)行枯草芽孢桿菌DZSY21菌懸液處理，再接種玉米小斑病菌分生孢子懸浮液的混合處理組(SB)；2)植物病原菌玉米小斑病菌分生孢子液處理(B)；3)枯草芽孢桿菌DZSY21菌懸液處理組(S)；4)空白對照處理(CK)。

每種處理20株為1組重復(fù)，設(shè)3組重復(fù)，菌株DZSY21引入玉米葉片，于接種玉米小斑病菌后的第4、6、8、10和第15 天進(jìn)行玉米小斑病害調(diào)查的同時(shí)，將提取上述4種處理組的玉米葉片的粗酶液。每種處理5株為1組重復(fù)，設(shè)3組重復(fù)。

1.6.1 酶活性測定 參照相關(guān)方法對PPO、POD和PAL 3種酶活進(jìn)行測定[10-11]。

1.6.2 誘導(dǎo)效應(yīng)計(jì)算公式 DZSY21在單菌體系中對玉米葉片3種酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)(分別用APPO、APOD、APAL表示)：A=(S處理組酶活性-CK處理組酶活性)/ CK處理組酶活性×100%。

DZSY21在雙菌體系中對玉米葉片3種酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)(分別用BPPO、BPOD、BPAL表示)：B=(SB處理組酶活性-B處理組酶活性)/ B處理組酶活性×100%。

1.7 生防菌DZSY21誘導(dǎo)玉米系統(tǒng)抗性的研究

1.7.1 RNA提取和CDNA合成

玉米種子(昌7-2) 依次用1%的次氯酸鈉表面消毒10 min，用無菌水沖洗3～5遍后進(jìn)行溫室(28℃～30℃)栽植。待玉米長至第9葉時(shí)期，將濃度為106cfu/mL DZSY21菌懸液噴灑在玉米植株下面的1～4片葉子上，培養(yǎng)12 h后，于相同部位接種玉米小斑病菌分生孢子懸浮液(含菌量為1.0×106cfu/mL)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理組： 1)在玉米葉片上先進(jìn)行枯草芽孢桿菌DZSY21菌懸液處理，再接種玉米小斑病菌分生孢子懸浮液的混合處理組(SB)；2)植物病原菌玉米小斑病菌分生孢子液處理(B)；3)空白對照處理(CK)。于玉米小斑病菌接種后的第12、24、36、48和第60小時(shí)取第6～9片葉的玉米葉片，進(jìn)行RNA提取。每種處理45株玉米植株，每次取樣 9棵玉米(3株為1組重復(fù)，3組重復(fù))，樣品為3株玉米植株第6～第9片葉的混合物。利用Invitrogen公司的試劑盒對樣品進(jìn)行RNA提取及cDNA合成。

1.7.2實(shí)時(shí)定量PCR

PCR反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCT[ΔCT=CT目標(biāo)基因-CT內(nèi)參基因。ΔΔCT=ΔCT處理后-ΔCT對照]計(jì)算公式計(jì)算所得的數(shù)據(jù)，每個(gè)樣重復(fù)3次。所測基因以及內(nèi)參基因的引物序列如表2所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌DZSY21引入玉米植株對玉米植株防御酶活性的影響

2.1.1 生防菌DZSY21引入玉米植株對玉米植株P(guān)AL活性的影響

玉米在不同生長時(shí)期葉片的PAL活性如表3所示。S處理及SB處理均可誘導(dǎo)玉米葉片的PAL活性，其中，接種玉米小斑孢子懸浮液后第6 天時(shí)，不同處理組的PAL活性均達(dá)到最大，隨著生長時(shí)間的延長，4種處理組酶活均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢；此外，不同生長時(shí)間段的S處理組的PAL活性增長率APAL均小于SB處理組的PAL活性增長率BPAL，說明SB處理組對玉米葉片PAL活性的誘導(dǎo)效應(yīng)好于S處理組。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

表3 不同處理組的玉米葉PAL活性

注：APAL，S處理組的PAL活性增長率；BPAL，SB處理組的PAL活性增長率

2.1.2 生防菌DZSY21引入玉米植株對玉米植株P(guān)0D活性的影響

表4為不同處理組的玉米植株在不同生長時(shí)期葉片的POD活性變化情況。S處理及SB處理均對玉米葉片POD活性有一定的誘導(dǎo)作用，接種玉米小斑孢子懸浮液后第8天時(shí)，上述兩種處理組的玉米葉片POD活性均達(dá)到最大。且SB處理對POD的誘導(dǎo)效應(yīng)大于S處理，接種玉米小斑病菌后3、4、6、8和10 d，SB處理POD活性增長值BPOD分別是S處理酶活增長值A(chǔ)POD的2.1、1.8、1.7、3.1和4.5倍。

表4 不同處理組的玉米葉POD活性

注：APOD，S處理組的POD活性增長率；BPOD，SB處理組的POD活性增長率

2.1.3 生防菌DZSY21引入玉米植株對玉米植株P(guān)PO活性的影響

表5為不同處理組的玉米植株在不同生長時(shí)期葉片PPO活性的變化情況。接種玉米小斑病菌后，SB處理組相對于其他處理組，可明顯提高玉米葉片PPO酶活性的變化，并在第8天酶活達(dá)到最大值。比較可知，接種玉米小斑病菌后額第4、6和第8天，S處理對PPO的誘導(dǎo)效應(yīng)大于SB處理，S處理POD活性增長值A(chǔ)PPO分別是SB處理酶活增長值BPPO的14.92、26.04和1.80倍。

表5 不同試驗(yàn)處理組的玉米葉部PPO活性

注：APPO，S處理組的PPO活性增長率；BPPO，SB處理組的PPO活性增長率

2.2 拮抗菌株DZSY21誘導(dǎo)玉米植株系統(tǒng)抗性(ISR)的研究

于接種玉米小斑病菌后的12、24、36、48和60 h對3種不同處理組中與水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)以及乙烯(ET)信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的PR-1、PDF1.2、LOX、ERF4個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析[12]。結(jié)果表明(圖1)枯草芽孢桿菌DZSY21菌懸液處理玉米葉片，能明顯誘導(dǎo)玉米植株中的PR1、LOX基因表達(dá)水平的上調(diào)，其PR-1的表達(dá)水平在接種后的第48小時(shí)，增強(qiáng)幅度分別約是對照處理組和B處理組的5.68倍、1.37倍，隨后表達(dá)水平略微降低；其LOX的表達(dá)水平于接種后的第12～36小時(shí)呈增加趨勢，并在接種后的第36小時(shí)達(dá)到最高，增強(qiáng)幅度分別約是對照處理組和B處理組的3.18倍、4.36倍。與此同時(shí)，經(jīng)DZSY21處理的玉米植株，PDF1.2、ERF兩種基因表達(dá)量上調(diào)趨勢相對較弱， 接種后的第36小時(shí)，其PDF1.2的表達(dá)水平相比對照，上調(diào)1.60；此外，玉米葉片引入DZSY21菌懸液，于接種病原菌后的不同生長時(shí)期，ERF基因的表達(dá)呈現(xiàn)緩慢上升并逐漸下降的趨勢。鑒于PR1是水楊酸途徑(SA)信號通路的關(guān)鍵基因，而LOX及PDF1.2是茉莉酸途徑(JA)信號通路的關(guān)鍵基因[13-14]，因此可知DZSY21菌株引入玉米葉片，誘導(dǎo)玉米中的水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)信號通路，激活LOX、PR1和PDF1.2基因的表達(dá)。

A：病程相關(guān)蛋白-1(PR-1)；B：脂氧合酶(LOX)；C：乙烯響應(yīng)因子(ERF)；D：擬南芥防衛(wèi)基因(PDF1.2)

圖1拮抗菌株DZSY21誘導(dǎo)玉米植株4種基因的表達(dá)變化

Fig 1 Expression of the four genes triggered by the endophytic bacterium DZSY21

3 討論

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是一類重要的植物生防菌，其對植物的生防機(jī)制是復(fù)雜多樣的，已有研究表明主要包括直接防病和間接防病途徑。直接防病主要指：芽孢桿菌自身可產(chǎn)生脂肽類等相關(guān)抗菌物質(zhì)[15]，或通過競爭等機(jī)制[16]來抑制植物病原菌的生長；芽孢桿菌的間接防病機(jī)制主要是刺激植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病性[17-18]，降低植物病害的發(fā)生。

芽孢桿菌的間接生防機(jī)制包括抗病信號的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)與調(diào)控等。其中苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine，PAL)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)以及多酚氧化酶(Polyphenol，PPO)在植物的抗病方面起著非常重要的作用，因此，這3種酶類通常被用來作為植物抗病性的判別指標(biāo)[19-20]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌DZSY21菌懸液處理玉米植株后，可誘導(dǎo)玉米葉片中PAL、POD、PPO等3種防御酶活性的變化，說明DZSY21作為外源刺激因子，能夠更好地誘導(dǎo)玉米體內(nèi)相關(guān)防御酶活性，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道生防菌能夠誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)酶活的結(jié)果一致[21-22]，不僅驗(yàn)證了這些酶與植物抗病性密切相關(guān)，還說明了DZSY21在一定程度上對增強(qiáng)玉米抗病性具有良好的效果。

目前，利用根圍促生細(xì)菌或外源化學(xué)因子激發(fā)植物抗病性的研究受到越來越多科學(xué)工作者的關(guān)注，如牛冬冬等[23]發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽孢桿菌 AR156可以誘導(dǎo)擬南芥形成SA、JA和ET信號途徑，對丁香假單孢菌形成的病害產(chǎn)生抗性。Tan等[24]]研究表明解淀粉芽孢桿菌T-5可以通過觸發(fā)SA、JA和ET信號通路，提高番茄植株的抗病性，從而有效防止番茄青枯病的發(fā)生。而利用植物內(nèi)生菌誘導(dǎo)植物抗病性的研究則相對較少，本研究利用杜仲拮抗內(nèi)生細(xì)菌DZSY21開展誘導(dǎo)玉米植株抗病性的相關(guān)研究，結(jié)果表明拮抗菌株DZSY21引入玉米葉片，可誘導(dǎo)玉米中的水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)信號通路，激活LOX、PR1和PDF1.2基因的表達(dá)。這一研究結(jié)果與已報(bào)道的大多數(shù)關(guān)于生防芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病性的研究具有相似之處。然而，一些研究也表明，芽孢桿菌屬微生物在一些植物上誘導(dǎo)形成的抗病性，并不單純通過上述我們所熟知的SA、JA和ET信號途徑，如Takahashi等人研究顯示生防微生物蘇云金芽孢桿菌則是通過激活SA依賴性信號通路和抑制JA依賴性信號通路，誘導(dǎo)對茄科植物對茄科植物的抗性[25]。由此可知，以芽孢桿菌屬為代表的有益微生物誘導(dǎo)植物ISR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的形成與有益微生物、寄主植物以及植物病原菌三者之間均存在著密切的關(guān)系。