范靜， 毛歡， 劉楚琪， 龍濤， 周康， 王萬軍

(西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都610031)

硫氧還原蛋白(thioredoxin，Trx)是生物體內廣泛存在的一種調節(jié)體內氧化還原反應的重要蛋白質。Trx的分子量較小，且都具有CXXC保守基序[1-3]。在擬南芥中，根據亞細胞定位可將Trx分為f、m、h、x、y和o共6個類型，f、m、x和y型主要存在于葉綠體中[4]，o型則在線粒體和細胞核中表達，而h型則在細胞質、細胞核、內質網和線粒體中均有發(fā)現[5-6]；早前也有根據Trx的特異性靶酶的不同而分類，如Trxf的靶酶為果糖-1,6-二磷酸磷酸酶，Trxm的靶酶為NADP-蘋果酸脫氫酶[7]等。近年在擬南芥中還發(fā)現了新的、與葉綠體發(fā)育相關的z型Trx[8]，以及大量的硫氧還原蛋白類超家族成員(ThioredoxinLike，TrxL)，這些超家族成員蛋白含有一個或多個Trx基序，但對其結構和功能的研究較少[7]。Trx可通過還原蛋白酶分子中的雙硫鍵，直接參與或間接影響種子中淀粉和儲存蛋白的合成與分解，從而在種子萌發(fā)初期調節(jié)胚乳中的碳氮代謝[9]。大麥種子的萌發(fā)中，Trx過量表達，可使淀粉酶活性增強，進而促進種子的萌發(fā)[10-11]。在細胞中，Trx1可以通過抑制抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)活性從而抑制蛋白激酶B(protein kinase，Akt)和凋亡信號調節(jié)酶1(apoptosis signal-regulation kinase 1，ASK1)，最終誘使細胞死亡；Trx1可分別激活AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]和細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，抑制細胞死亡；Trx1也可通過NF-κB途徑最終抑制細胞死亡[12-15]。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)是蘭科石斛屬多年附生草本植物，目前鐵皮石斛的相關研究主要在多糖的代謝、原球莖發(fā)育、以及菌根分子相互作用等方面[16]。原球莖發(fā)育是蘭科植物胚胎的特殊發(fā)育機制，本研究以鐵皮石斛為材料，采用RACE技術克隆得到一個TrxL 超家族成員基因DoTrxL2，并結合生物信息軟件進行蛋白特征分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建，通過實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)技術分析該基因在鐵皮石斛不同組織以及原球莖發(fā)育時期的表達量差異，探究DoTrxL2基因在鐵皮石斛發(fā)育過程中的作用，為后續(xù)研究硫氧還蛋白基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛成熟種子在不含激素的1/2MS半固體培養(yǎng)基(1/2MS大量元素+MS微量元素及有機元素+MS鐵鹽)上經原球莖發(fā)育途徑形成完整植株。

選取成熟種子以及培養(yǎng)過程中處于原球莖形成期(P1)、原分生組織形成期(P2)、頂端分生組織形成期(P3)、橢球形原球莖期(P4)、葉原基維管系統(tǒng)形成期(P5)、根端分生組織形成期(P6)、原球莖退化和苗的形成(P7)等7個時期的原球莖各100 mg。

選取鐵皮石斛無菌幼苗在壯苗培養(yǎng)過程中其基部形成的類原球莖100 mg；選取長勢較好、整齊一致、并具5～6片葉的新鮮幼苗，分別取其根、莖、葉組織各100 mg；選取盆栽鐵皮石斛植株開花期的將要開放的全花組織100 mg。

以上所有樣品均取3個平行樣，取樣后迅速放入液氮中速凍，然后轉入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成

按照Plant RNA Kit(OMEGA)方法對各鐵皮石斛實驗材料進行總RNA提取，并用RNase-free DNase I(TaKaRa)去除總RNA中的基因組污染。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇具清晰的28S rRNA和18S rRNA條帶、無彌散條帶且OD260/OD280≥1.8的樣品用于后續(xù)的基因克隆及熒光定量PCR。

將合格的RNA立即采用TaKaRa逆轉錄試劑盒獲得cDNA。

1.2.2DoTRXL2基因克隆及測序

根據已經獲得的鐵皮石斛轉錄組序列用primer premier 5.0設計3′RACE巢式引物(表1)，引物由上海生工公司合成。以cDNA為模版克隆，PCR反應體系為25 μL(EasyTaqDNA Polymerase 0.15 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 18.35 μL、dNTPmix 1 μL、EasyTaqbuffer 2.5 μL)，擴增條件為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸2 min；72℃再延伸5 min。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增所得目的片段經膠回收，pGEM-T easy載體連接，質粒轉化，藍白斑篩選并挑取單克隆并送至上海生物工程公司進行測序。根據測序所得的序列設計qRT-PCR引物用于實時熒光定量PCR實驗(表1)。

表1 DoTRXL2克隆引物及qRT-PCR所用引物

1.2.3 序列分析

根據所得序列，利用BioXM軟件的ORF功能預測開放閱讀框；用NCBI Blastp分析其保守結構域；利用NCBI的BLAST在線分析工具選出與基因序列相近的其他物種序列，利用DNAMAN對其進行比對分析；利用Protparam軟件分析DoTrxL2的理化性質；利用DNAstar軟件中Protean模塊對DoTrxL2進行二級結構預測。將DoTrxL2進行blastp搜索，選取與其一致性70%以上的不同植物，一共46條Trx基因，使用MEGA6的鄰近法(NJ)構建進化樹。

1.2.4 熒光定量PCR檢測基因在不同組織和原球莖不同發(fā)育時期的表達

利用實時熒光定量PCR的方法檢測DoTrxL2基因在鐵皮石斛不同組織和鐵皮石斛種子不同發(fā)育時期的相對表達量。通過primer premier 5.0對已得到的克隆序列設計定量引物見表1。將提取的各類cDNA按10 μL反應體系進行擴增(SYBR green 5 μL、cDNA 0.5 μL、MilliQ ddH2O 2.9 μL、引物各0.8 μL)，反應體系為預變性95℃ 30 s；95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸25 s，擴增45個循環(huán)；72℃再延伸30 s。擴增完成后運用LightCycler?96 SW 1.1軟件進行誤差分析，采用2-ΔΔCt分析方法對DoTrxL2進行相對定量表達分析。

2 結果與分析

2.1 DoTRXL2的克隆及序列分析

根據已經獲得的DoTrxL2核心序列設計3′RACE引物(表1)，進行PCR擴增，擴增結果如圖1。將測序后的序列在NCBI數據庫中進行Blast分析，驗證了所得基因序列為DoTrxL2的cDNA完整序列。其中開放閱讀框(ORF)長度為639 bp，編碼213個氨基酸，命名為DoTrxL2(NCBI序列號為KX524080.1)，見圖2。用NCBI Blastp分析其保守結構域，結果顯示該產物有一個Trx家族特有的結構域，即Cys-Gly-Ser-Cys(圖3黑色方框表示)。將該序列在NCBI中進行blastp分析，選取與其相近的16條序列進行DNAMAN蛋白比對分析，發(fā)現該結構域非常保守(圖3紅色框線)，除此外，在此序列后的C-端還有3個C殘基(黑色三角形表示)，進一步證明克隆所得為Trx家族基因。

圖1 DoTrxL2 PCR擴增結果

圖2 DoTrxL2的核酸序列與氨基酸序列

圖3 DNAMAN比對的DoTrxL2的CXXC結構域

注：圖中各條序列的accesion number分別為DoTRXL2(鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo，APB87930.1)；EgTRXL2(油棕Elaeisguineensis，XP_010915239.1)；PdTRXL2(海棗Phoenixdactylifera，XP_008782549.1)；AcTRXL2(菠蘿Ananascomosus，XP_020096762.1)；ZomTRX(大葉藻Zosteramarina，KMZ59737.1)；NnTRXL2(蓮Nelumbonucifera，XP_010262166.1)；PeuTRXL2(胡楊Populuseuphratica，XP_011014007.1)；VvTRXL2(葡萄Vitisvinifera，XP_002282326.1)；ZmTRXL2-2(玉米Zeamays，AQK84723.1)；GaTRXL2 木本棉Gossypiumarboreum，XP_017617040.1)；DcTRXL2(胡蘿卜Daucuscarota，XP_017240278.1)；JrTRXL2(胡桃Juglansregia，XP_018845883.1)；RcTRX(蓖麻Ricinuscommunis，EEF48055.1)；OsTRXL6(水稻Oryzasativa，BAS92705.1)；GmTRXL2(大豆Glycinemax，XP_003517423.1)；PeTRXL2 (小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris，XP_020585481.1)；AoTRXL2(龍須菜Asparagusofficinalis，XP_020251035.1)

2.2 DoTrxL2的生物信息學分析

用ProtParam軟件進行蛋白質基本性質預測，DoTrxL2基因編碼的蛋白分子量為23 794.48 ku，理論pI為5.09，所帶的負電荷(Asp + Glu)總數為23，正電荷(Arg+Lys)總數為29，分子式為C1066H1681N297O301S10，不穩(wěn)定系數為35.06，表明該蛋白較穩(wěn)定。

運用DNAStar中Protean程序對DoTrxL2進行蛋白質二級結構分析，結果顯示DoTrxL2蛋白質的二級結構由11個α-螺旋、4個β-折疊、13個T-轉角和14個無規(guī)則卷曲組成(圖4)。利用TMHMM對蛋白質跨膜區(qū)特性進行分析，結果顯示該蛋白主要分布于膜外，不含跨膜位點。

利用PSORT亞細胞定位預測顯示，該蛋白主要分布于植物細胞葉綠體中，極少量分布在細胞核中。

圖 4 鐵皮石斛DoTrxL2蛋白二級結構預測

2.3 DoTrxL2系統(tǒng)發(fā)育樹構建

圖5 不同物種硫氧還蛋白基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

注：圖中各條序列的accesion number分別為DoTRXL2(鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo，APB87930.1)；PheTRXL2(小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris，XP_020585481.1)；EgTRXL2(油棕Elaeisguineensis，XP_010915239.1)；AoTRXL2(龍須菜Asparagusofficinalis，XP_020251035.1)；PdTRXL2(海棗Phoenixdactylifera，XP_008782549.1)；AcTRXL2(菠蘿Ananascomosus，XP_020096762.1)；NnTRXL2(蓮Nelumbonucifera，XP_010262166.1)；PeTRXL2(胡楊Populuseuphratica，XP_011014007.1)；VvTRXL2(葡萄Vitisvinifera，XP_002282326.1)；TcTRX2(可可Theobromacacao，EOX96498.1)；JrTRXL2(胡桃Juglansregia，XP_018845883.1)；BdTRXL2(二穗短柄草Brachypodiumdistachyon，XP_003568764.1)；RcTRXL2(蓖麻Ricinuscommunis，XP_002514101.1)；GmTRXL2(大豆Glycinemax，XP_003529085.1)；GsTRXL2(野生大豆Glycinesoja，KHN32916.1)；SiTRXL2(芝麻Sesamumindicum，XP_011093720.1)；CacTRXL2(木豆Cajanuscajan，XP_020239980.1)；FvTRXL2(棉花Gossypiumhirsutum，XP_011459858.1)；CcTRX(黃麻Corchoruscapsularis，OMO69628.1)；PmTRXL2(青梅Prunusmume，XP_008242407.1)；AetTRXL2(節(jié)節(jié)麥Aegilopstauschii，XP_020165732.1)；NtTRXL2(煙草Nicotianatabacum，XP_016479657.1)；CaTRXL2(鷹嘴豆Cicerarietinum，XP_004513104.1)；VaTRXL2(赤豆Vignaangularis，XP_017440281.1)；ZmTRXL6(玉米Zeamays，NP_001149676.1)；CsTRXL2(黃瓜Cucumissativus，XP_004133814.1)；ZjTRXL2(棗Ziziphusjujuba，XP_015889122.1)；InTRXL2(牽牛Ipomoeanil，XP_019150855.1)；SlTRXL2(番茄Solanumlycopersicum，XP_004253215.1)；SeiTRXL2(小米Setariaitalica，XP_004960923.1)；MdTRXL2(蘋果Malusdomestica，XP_008337697.1)；StTRXL2(馬鈴薯Solanumtuberosum，XP_015163827.1)；GaTRXL2(木本棉Gossypiumarboreum，XP_017643280.1)；CaaTRXL2(辣椒Capsicumannuum，XP_016580284.1)；RsTRXL2-2(蘿卜Raphanussativus，XP_018471912.1)；ThTRXL2-2(醉蝶花Tarenayahassleriana，XP_010526398.1)；BvTRXL2(甜菜Betavulgaris，XP_010677990.1)；BrTRXL1-1(白菜Brassicarapa，XP_009148112.1)；CasTRXL1-1(亞麻薺Camelinasativa，XP_010458099.1)；BoTRXL1-1(甘藍Brassicaoleracea，XP_013587205.1)；PvTRX(菜豆Phaseolusvulgaris，AGV54520.1)；DcTRXL1-1(胡蘿卜Daucuscarota，XP_017239001.1)；LlTRX(麝香百合Liliumlongiflorum，AAA33400.1)；TuTRXL1-1(烏拉爾圖小麥Triticumurartu，EMS65805.1)；CycTRX(刺菜薊Cynaracardunculus，KVH90699.1)；OsTRXL1-1(水稻Oryzasativa，XP_015631589.1)

將DoTrxL2序列的氨基酸序列在NCBI上進行Blastp比對后，將選取的46條序列通過ClustalX比對后，用MEGA6構建DoTrxL2的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結果顯示，不同植物的Trx基因聚為3支，其中，C類全為雙子葉植物，B類全為單子葉植物，A類中除LlTrx和TuTrxL1-1為單子葉，其余為雙子葉植物。并且發(fā)現C類和B類親緣關系較近，而A類親緣關系較遠。DoTrxL2屬于B類，并與小蘭嶼蝴蝶蘭、石刁柏等單子葉植物親緣關系較近，這與鐵皮石斛屬于單子葉蘭科的植物分類學特征相符。

2.4 DoTrxL2在不同組織及原球莖不同發(fā)育時期中的表達分析

采用2-△△Ct方法對原始Ct值進行計算后得出DoTrxL2基因的相對表達量，結果如圖6所示。結果顯示，DoTrxL2基因在鐵皮石斛原球莖不同時期的表達差異不大，相對表達量最高最低相差大約20%。與原球莖形成時期相比，總體趨勢為先下降后緩慢上升最后下降。其中原分生組織形成以及原球莖退化和苗的形成兩個時期表達量較低，且兩者相差不大；原球莖形成時期，葉原基維管系統(tǒng)形成時期和根端分生組織形成時期的表達量基本持平。

DoTrxL2基因在鐵皮石斛不同組織中差異表達，在種子中表達量最高，是其在根中表達量的8.26倍；在花中的表達量是根的6.53倍；而在莖、葉、類原球莖差異不大，表達量是根的3～4倍。

3 討論

Trx的二級結構較為保守，大多數由4個β折疊與其外包圍著的5個α螺旋組成，活性中心在β2的尾部與α2的起始端之間[17]。Trx中活性中心CXXC的半胱氨酸對Trx的還原活性起著主導作用，而研究XX序列的不同突變體發(fā)現XX序列對不同蛋白質互作和維持蛋白質三維結構有重要的作用[18-19]。利用PCR點突變的方法，將煙草硫氧還蛋白基因(NtTrxh)活性位點WCGPC以外的3個C進行替換，發(fā)現突變蛋白均失去催化活性，表明NtTrxh氮末端的C殘基也是催化反應所必須的[20]。而本研究中DoTrxL2碳末端的3個C殘基，可能對維持蛋白質三維結構和催化活性有著重要作用。

圖6 原球莖不同發(fā)育時期、不同組織中DoTrxL2基因表達分析

注：P2-P8分別代表原球莖形成、原分生組織形成、頂端分生組織、橢球形原球莖、葉原基維管系統(tǒng)形成、根端分生組織形成、原球莖退化和苗的形成；R、St、L、F、Se分別表示根、莖、葉、花、種子和類原球莖時期

Trx作為細胞氧化還原系統(tǒng)的關鍵蛋白參與細胞的基礎代謝，在種子的萌發(fā)過程中有著重要作用。DoTrxL2在不同原球莖發(fā)育時期基礎表達量均較大，表明DoTrxL2對原球莖的發(fā)育是必須的；而各時期表達量有差異但不顯著，預示著DoTrxL2調控原球莖的發(fā)育代謝。在小麥(TriticumaestivumL.)種子萌發(fā)過程中，Trxh可通過誘導氯仿/甲醇可溶蛋白轉換為代謝活性蛋白增強代謝途徑，降解貯藏蛋白和增強GOGAT(glutamine oxoglutarate aminotransferase)活性促進種子萌發(fā)[21]。DoTrxL2在原球莖形成初期活化種子，促進原球莖形成；而到了原球莖發(fā)育后期，則促進原球莖葉和根的發(fā)生。在鐵皮石斛原球莖發(fā)育成苗的過程中，會伴隨著細胞的凋亡而使原球莖的形態(tài)發(fā)生變化。如在P4時期，原球莖的頂端會出現一個小凹槽；在P5時期、P6時期以及P7時期，原球莖的下部逐漸由圓球形變?yōu)閱♀徯危詈笙露送耆嘶痆22]。在這些時期中DoTrxL2的相對表達量均有所上調，推測該基因介導的細胞凋亡途徑對原球莖的形態(tài)發(fā)育有著重要影響[12, 22-23]。在植物早期發(fā)育過程中，Trx參與的硫氧化還原系統(tǒng)是葉綠體發(fā)育和維持葉綠體化合作用所必需的[24]。

DoTrxL2在不同組織中都有所表達，趨勢為：種子>花>莖>葉>類原球莖>根。相關研究表明Trx在植物不同組織中均有表達且有所差異。鐵皮石斛DoTrxm1和丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)SmTrxh在根中表達量高而在葉中表達較少[25-26]；甘蔗(Saccharumofficinarum)硫氧還蛋白基因ScTRXh2在葉片和莖中的表達量顯著高于根和芽[27]；而巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)中HbTRX基因則在愈傷中大量表達,膠乳中次之,在花、葉、芽、樹皮中均微量表達[28]。對豌豆(PisumsativumL.)的非光合器官如花、種子和根中的Trx進行研究，通過對與Trx偶聯的β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)進行組織化學染色，發(fā)現Trxf和Trxm均有所表達，并參與植物細胞分裂過程和植物生殖過程[29]。Trx不同成員的組織特異性表現不同，推測Trx不同成員相互協(xié)調調控植物的生長發(fā)育[27-28, 30]。DoTrxL2在花和種子中的表達量較高，推測該基因特異調控植物的生殖發(fā)育，在生殖生長中參與基礎代謝。當植物遭受氧化脅迫壓力時，Trx通過與過氧化物氧化還原酶的相互作用，參與清除有毒害的有活性氧類物質(reactive oxygen species，ROS)，對維持細胞的氧化還原平衡有重要作用[31]。在植物抵御低溫、高鹽、干旱等逆境時，能對抗逆基因的表達進行調控，從而增強植物抗逆性[32]。