焦 雪，劉文昊，馬明建，錢 昊，許曉玲，王瓊丹，吳 慶

(遵義醫(yī)學院藥學院，貴州 遵義 563000)

0 引 言

重金屬Ag+因具有良好的光、電學特性被廣泛應(yīng)用于各個行業(yè)，每年有大量的含Ag+廢水排放到環(huán)境當中，成為重金屬污染最嚴重的離子之一[1-2]。如果人長期暴露在高濃度的銀離子環(huán)境或者通過食物鏈的富集進入人體，都會對人體造成一定的損害，特別是對大腦、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)的傷害[3]。因此需要建立一種快速、靈敏的傳感器可實時監(jiān)測排放廢水及地表水中的Ag+濃度。目前Ag+檢測常用檢測方法主要是熒光光譜法[4]、電化學分析法[5]、原子吸收光譜法[6]、表面增強拉曼光譜法[7]和電感耦合等離子質(zhì)譜法[8]等，但這些方法都存在各自的缺點，如需要大型儀器，前期樣品處理復(fù)雜、耗時較長、不易攜帶等。近年來，納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展為重金屬離子的檢測提供了新思路，許多基于納米材料建立起來的檢測重金屬的化學生物傳感器被研究報道[9-11]。如Yang等[12]利用Ag+能和富含C堿基的DNA構(gòu)成特殊的結(jié)構(gòu)而被綠色熒光染料識別，構(gòu)建了一種簡單快速檢測Ag+的熒光方法；Hu等[13]通過Ag+能夠加速肽鏈修飾的Au納米顆粒團聚的作用，采用比色法簡單快速超靈敏檢測Ag+。盡管如此，基于納米材料的特殊性質(zhì)開發(fā)的傳感器方法在設(shè)計和方法靈敏度上需要進一步提高。

自2007年，閻錫蘊課題組[14]發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米材料具有過氧化物模擬酶性質(zhì)之后，許多金屬納米粒子(如貴金屬納米粒子金屬氧化物和碳納米材料[15]等)較好酶的活性被研究。納米材料模擬酶與天然酶相比，能克服天然酶不耐高溫、不耐pH和易于失活等缺點，因此納米材料獲得了廣泛的關(guān)注。近年來，基于納米材料的模擬酶特性建立的檢測重金屬離子的方法得到了發(fā)展，如Yang等合成了MnO2納米棒并證明該材料具有過氧化物模擬酶的特性，谷胱甘肽能抑制其模擬酶特性使TMB褪色，而Hg2+加入可以使TMB重新顯色，基于此建立了高靈敏檢測Hg2+的方法；Zhang等制備了rGO/PEI/Pd雜交納米材料，當加入Hg2+時其催化活性增強，建立了快速低檢出限的Hg2+檢測方法；Song等通過檸檬酸和硼氫化鈉還原制備高分散性的Pt納米粒子，由于其中的檸檬酸可以將Ag+還原成為Ag0，而Ag0又覆蓋到Pt納米粒子上抑制其納米酶催化活性，建立檢測Ag+的傳感器。

本文通過簡單的微波輔助合成方法制備了具有過氧化物模擬酶特性的Mo/CeO2NPs，當Ag+存在時會對其催化活性產(chǎn)生強烈的抑制作用，基于此構(gòu)建了高靈敏的Ag+比色檢測方法。該方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、檢測快速、成本低等優(yōu)點，可潛在應(yīng)用于實際樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

T9CS型雙光束子紫外可見分光光度計（中國惠普有限公司），KM-36C型超聲波清洗機（廣州市科潔盟實驗儀器有限公司），ME204E型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），微波反應(yīng)器（GEM公司），DK-98-11電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），PHS-25型PH指示劑（上海儀電科學儀器）、硝酸鈰（Ce(NO3)3·6H2O，阿拉丁工業(yè)公司）,鉬酸銨（(NH4)6Mo7O24·4H2O，阿拉丁工業(yè)公司），3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯鹽酸鹽（TMB·2HCl，無水級，98%，阿拉丁工業(yè)公司）、30%過氧化氫、硝酸銀（AgNO3）、乙酸鈉、冰醋酸、硼酸，所有試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。實驗用水由NEX UP純水系統(tǒng)(韓國Human公司)制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 mo/CeO2NPs的制備

準確稱取0.222 4 g (NH4)6Mo7O24·4H2O與0.790 3 g Ce(NO3)3·6H2O置于50 mL燒杯中，加20 mL去離子水溶解，不斷攪拌并緩慢滴加0.1 mol/L的NaOH溶液至pH等于12.0，繼續(xù)攪拌10 min。將溶液放入微波反應(yīng)器，在100 ℃下反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后，離心收集反應(yīng)產(chǎn)物，去離子水洗滌3次。放入真空干燥箱，在80 ℃下干燥6 h。

再分散溶液：上述樣品用瑪瑙研缽研細，稱取0.002 4 g，加入4 mL去離子水。放入超聲波清洗機中超聲分散均勻。制得0.6 mg/mL的樣品分散液。

1.3 mo/CeO2NPs模擬酶活性的測定

以 TMB·2HCl為反應(yīng)底物，測定 Mo/CeO2NPs的過氧化物模擬酶的性質(zhì)。具體實驗步驟為：依次將2 mL醋酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=4.0)、10 μL 0.6 mg/mL 的樣品分散液、100 μL H2O2溶液 (10 mmol/L)、100 μL 的 TMB·2HCl (5 mmol/L)溶液加入到4 mL的Ep管中。在40 ℃下孵育30 min，在652 nm處測量紫外吸收。

1.4 銀離子的檢測

于2 mL的Ep管中分別吸取1.7 mL的不同pH的緩沖溶液，然后分別加10 μL Mo/CeO2NPs分散液（0.6 mg/mL），100 μL H2O2溶液（10 mmol/L），100 μL的TMB·2HCl (5 mmol/L)溶液振蕩后，于最優(yōu)溫度45 ℃ 孵育5 min，移取100 μL 的AgNO3(0.25 mmol/L)在45℃下孵育10 min在652 nm處測紫外吸收。

2 結(jié)果與討論

2.1 mo/CeO2NPs的表征

圖1（a）為Mo/CeO2NPs的X-射線粉末衍射（XRD）圖，該晶體衍射圖與CeO2標準圖譜一致。該納米材料具有立方螢石結(jié)構(gòu)，但從XRD圖中未發(fā)現(xiàn)其他雜質(zhì)峰，可能是由于摻雜的Mo含量較少，所以在XRD中沒有出現(xiàn)Mo元素的衍射峰。Mo/CeO2NPs的元素分析和電子狀態(tài)可以通過X-射線光電子能譜(XPS)進行表征分析，圖1（b）顯示了Mo/CeO2NPs的XPS全譜，在230～238 eV范圍內(nèi)出現(xiàn)了Mo 3d的譜圖，證明通過該方法合成的材料中摻雜有Mo離子。同時，通過XPS可以獲得Ce的光譜圖，可分為兩個部分：875～895 eV的峰屬于 Ce 3d5/2和895～910 eV的峰屬于Ce 3d3/2，與文獻報道結(jié)果一致。圖2（a）是在最優(yōu)條件下合成的Mo/CeO2NPs的掃描電子顯微鏡(SEM)圖，圖中表明合成的材料呈現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀，有少量團聚，粒徑尺寸分布不均。為了進一步證明該材料由小的納米顆粒形成，通過原子力顯微鏡(AFM)圖（圖2（b））所示，該材料由粒徑大約為25 nm的小顆粒團聚而成，表面不光滑，納米材料厚度不均一。

圖1 mo/CeO2NPs的XRD圖和XPS圖

圖2 mo/CeO2NPs的SEM圖和AFM圖

2.2 mo/CeO2NPs的過氧化物酶的特性

為了探究Mo/CeO2NPs的模擬酶活性，以過氧化物酶的底物(TMB·2HCl)為顯色底物，H2O2為氧化底物，Mo/CeO2NPs作為催化劑，考察該體系的顯色反應(yīng)，評價其過氧化物模擬酶的催化特性。在0.2 mol/L NaAc緩沖溶液 (pH 4.0)中，Mo/CeO2NPs能夠催化H2O2氧化TMB·2HCl產(chǎn)生經(jīng)典顯色反應(yīng)。氧化TMB在652 nm處有特征吸收峰出現(xiàn)，證明了Mo/CeO2NPs具有類似天然辣根過氧化物酶的活性。

實驗發(fā)現(xiàn)，銀離子可以抑制Mo/CeO2NPs光催化模擬酶的活性，基于此可建立檢測銀離子的方法，其檢測原理如圖3所示。Mo/CeO2NPs具有類過氧化物酶活性，可催化TMB· 2HCl與H2O2的顯色反應(yīng)，使溶液呈藍色。向體系中加入Ag+后，可明顯抑制顯色反應(yīng)的進行，導(dǎo)致溶液顏色變淺?；诖私⒘薃g+的識別體系，通過測量體系紫外-可見吸收光譜的變化定量測定的Ag+濃度。

圖3 不同反應(yīng)體系的測定結(jié)果

2.3 體系pH值和溫度對Mo/CeO2NPs模擬酶催化活性的影響

Mo/CeO2NPs同其他無機納米材料過氧化物模擬酶和天然酶HRP一樣，其催化活性受體系的pH和溫度的影響。同時考察加入Ag+后的催化活性受體系的pH和溫度的影響。實驗固定溫度為25 ℃，記錄pH從1.0～12.0變化時特征吸收峰的變化；再固定pH為4.0，記錄溫度從10 ℃到90 ℃時的變化。如圖4所示，對于Mo/CeO2NPs模擬酶來說，當pH為4.0和溫度為50 ℃時，該模擬酶催化活性最大。而相對于加入Ag+后的抑制體系，考察體系pH和溫度對于該催化活性抑制的影響，優(yōu)化其最佳pH為4.0，最適溫度為45 ℃。因此，pH為4.0，溫度為45 ℃作為最佳反應(yīng)條件應(yīng)用于接下來的分析檢測中。

圖4 pH和溫度對Ag+加入前后體系體系活性的影響

2.4 Ag+的檢測

在最優(yōu)實驗條件下，測定了不同濃度Ag+存在時，溶液的吸光度差值與Ag+濃度的關(guān)系圖。如圖5所示，隨著Ag+濃度增大，體系在652 nm處的吸吸收值不斷減小，其吸光度差值逐漸增加，說明Mo/CeO2NPs的催化活性被逐漸抑制，其中插圖為線性關(guān)系圖及不同濃度的比色圖片。通過比色法對 Ag+檢測線性范圍為1.0×10–7～2.0×10–5mol/L，檢出限為0.9×10–7mol/L。本實驗可應(yīng)用于實際樣品的檢測，利用實驗室自來水作為樣品，通過ICPMS檢測其含量，向樣品中加標，使Ag+的濃度達到5×10–7，1×10–6，2×10–6mol/L，過濾后檢測。其 3 個加標濃度下的回收率分別為96.8%，98.4%和102.7%，相對標準偏差分別為6.6%，5.4%和5.0%。上述結(jié)果表明，利用Mo/CeO2NPs在實際樣品中檢測Ag+的方法具有較高的準確性和可靠性。本文建立的比色方法簡便快捷，無需復(fù)雜儀器，耗時短，反應(yīng)條件較溫和，相較于其他檢測方法具有較好優(yōu)勢。

圖5 mo/CeO2NPs作為模擬酶檢測Ag+的響應(yīng)曲線（插圖為線性關(guān)系圖）

2.5 干擾性實驗

考察了幾種可能存在的干擾物質(zhì)，包括以下離子 (Ba2+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cu2+，Mn2+，Ni2+，Pb2+，Zn2+)對比色測定Ag+的影響，干擾物質(zhì)的濃度均為Ag+濃度的5倍。 如圖6所示，除Mn2+對Mo/CeO2NPs的催化活性有輕微抑制作用，其他離子均未引起顯色反應(yīng)明顯的變化，說明本方法具有較好的選擇性。

圖6 不同離子對比色法測定Ag+的選擇性影響

3 結(jié)束語

本文采用一種簡單的水熱法合成了具有模擬酶催化活性的Mo/CeO2NPs，考察了Ag+對Mo/CeO2NPs催化作用的影響。Mo/CeO2NPs催化TMBH2O2的反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物，Ag+可以抑制Mo/CeO2NPs的催化活性，在最佳實驗條件下，實現(xiàn)了Ag+的快速、靈敏、選擇性好的比色檢測。此檢測體系具有儀器簡單，靈敏度高，檢出限低，方便快速等優(yōu)點。