宋先忱，李 冰，朱延旭，張興會，王世泉，郭 伶，徐 鵬，郭維軍，劉孝剛

(1遼寧省畜牧科學研究院，遼寧遼陽111000 ； 2.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州121001 ；3.錦州市動物疫病預防控制中心，遼寧錦州121002)

副結核病是由副結核分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性傳染病，以頑固性腹瀉、逐漸消瘦、腸黏膜增厚為特征。主要感染牛、羊、鹿等反芻動物。該病1958年在地中海首次發(fā)現(xiàn)，同期我國內(nèi)蒙古也發(fā)現(xiàn)了1例，隨后該病迅速蔓延至全國大部分地區(qū)[1-2]，給我國牛羊飼養(yǎng)業(yè)帶來了極大損失[3]。

遼寧南部地區(qū)某絨山羊養(yǎng)殖場，有少部分母羊產(chǎn)羔后陸續(xù)出現(xiàn)頑固性腹瀉、逐漸消瘦，后期食欲廢絕而衰竭死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)回腸和結腸腸黏膜增厚、腸系膜淋巴結水腫、脾臟明顯萎縮等一系列臨床癥狀和剖檢病變，初步診斷為副結核病[3]，為了對本病進一步確診，同時為今后絨山羊副結核病的診斷與防控工作提供科學依據(jù)，開展了本項試驗工作。

1 材料與方法

1.1 病原分離鑒定

1.1.1 材料 病料來源，遼寧南部地區(qū)某絨山羊養(yǎng)殖場疑似副結核病羊1只，剖檢后無菌操作采取心、肺、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結及腸道內(nèi)容物。

Dubods油酸瓊脂培養(yǎng)基，購自招遠拓普生物工程有限公司；石炭酸復紅溶液、3%鹽酸酒精(脫色劑)、堿性美藍復染(復染液)均由本校微生物實驗室提供。

1.1.2 方法 將心、肺、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結6個部位的病料先用4%H2SO4處理30 min，經(jīng)中和后再無菌操作接種到Dubods油酸瓊脂培養(yǎng)基上，腸內(nèi)容物及黏膜用刀片刮取，放入40 mL、0.75%HPC(氯化十六烷基吡啶)塑料管中，于室溫下豎立48 h后以去污染物，再用滴管吸取沉淀物上層液體，接種于培養(yǎng)基中。

在37 ℃條件下培養(yǎng)9～13周，詳細觀察菌株生長情況，前8周每2周觀察1次，后5周每2 d觀察1次。出現(xiàn)疑似菌落樣品，挑取單個菌落，進行抗酸染色鏡檢，觀察是否符合副結核分支桿菌的形態(tài)特征。

2 分離菌的PCR檢測

2.1 材料 DL-2 000 Marker，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；2×TaqMaster Mix(含染料)，購自北京全式金生物科技有限公司；核酸染料；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生物工程技術有限公司；小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物的設計 選擇王素華[4]設計的副結核分枝桿菌特性引物，預期產(chǎn)物246 bp，引物由(上海)生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 特異性引物相關信息

2.2.2 細菌基因組DNA提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書介紹的方法提取基因組。提取的基因組，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 PCR擴增 94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，最終4 ℃保存。PCR反應體系30 μL：模板3 μL、2×TaqMaster Mix 15 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 10 μL。

2.2.4 PCR產(chǎn)物電泳：PCR擴增后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，取5 μL DNA Marker和5 μL PCR擴增產(chǎn)物加到樣品孔，在1xTAE電泳緩沖液中，120 V 電壓電泳30 min，在凝膠系統(tǒng)中觀察結果。

2.2.5 PCR產(chǎn)物序列測定與分析：將PCR 產(chǎn)物膠回收，委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，并將結果與GenBank中的基因序列進行比較分析。

3 結果

3.1 病原分離鑒定結果 經(jīng)過9～13周培養(yǎng)后，在接種肝臟病料的培養(yǎng)基上長出乳白色、光滑、邊緣整齊的菌落，見中插彩版圖1，在接種心、肺、脾、腎、腸系膜淋巴結及腸內(nèi)容物的6個培養(yǎng)基上沒有長出上述形態(tài)的菌落，只有一些雜菌生長。挑取疑似單個菌落進行抗酸染色鏡檢后，可見不規(guī)則(單個、成叢)的紅色短小桿菌，見中插彩版圖2。

3.2 PCR檢測結果 提取DNA基因組，對所分離出來的疑似羊副結核分支桿菌進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物上樣量每孔5 μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2 000 Plus DNA Marker為標準，可見在246 bp左右有明顯的目的條帶，與預期的目的條帶大小一致，見圖3。

3.3 測序分析結果 目的基因擴增產(chǎn)物測序結果為246 bp，見圖4。通過BLAST在線比對，同源性在95%以上的有16株，其中與JⅡ-1961(CP022105.1)菌株同源性達100%，進一步證實了分離菌株為副結核分支桿菌。

圖3 羊副結核分支桿菌PCR鑒定結果注：M∶DL-2 000 Plus DNA Marker ； 1：分離菌株 ； 2：陰性對照

圖4目的基因擴增產(chǎn)物測序結果

4 討論

副結核分枝桿菌主要從感染患病動物的糞便或內(nèi)臟組織中分離獲得，由于副結核病潛伏期長以及副結核分枝桿菌對培養(yǎng)基要求條件苛刻，造成該病原體初代分離非常困難，一般需要6～8周的時間才能生長出肉眼可見的菌落，長者可達6個月[5]。所以國內(nèi)關于該病的病原分離鑒定方面的研究報道很少，吳建勇等[6]采集新疆地區(qū)發(fā)病奶牛的糞便病料，在HEYM培養(yǎng)基上經(jīng)過8～12周時間成功培養(yǎng)出副結核分枝桿菌，并經(jīng)PCR檢測和基因序列比對分析證實新疆地區(qū)規(guī)模化奶牛場中存在副結核分枝桿菌感染。

本試驗采集遼寧地區(qū)發(fā)病絨山羊的內(nèi)臟組織和腸內(nèi)容物病料，在Dubods油酸瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)過37 ℃、9～13周時間培養(yǎng)，經(jīng)抗酸染色鏡檢結果表明，從發(fā)病羊的肝臟組織中成功分離出一株副結核分枝桿菌，并經(jīng)PCR檢測和基因序列比對分析進一步證實了分離菌即為副結核分枝桿菌。從而首次證實遼寧地區(qū)絨山羊飼養(yǎng)場中存在副結核分枝桿菌感染。

副結核分枝桿菌主要存在于感染患病動物的糞便或內(nèi)臟組織中，本研究在同一只發(fā)病羊的肝臟中分離出副結核分枝桿菌，而在心、肺、脾、腎、腸系膜淋巴結及腸內(nèi)容物6種病料組織中沒有分離出副結核分枝桿菌，分析其中原因，可能與不同發(fā)病時期各內(nèi)臟組織中的帶菌量有關，具體原因還有待于進一步研究探討。

關于副結核分枝桿菌的培養(yǎng)時間，各種文獻說法不一，有6～8周或6個月[7]、5～14周[2]、8～12周[6]等，本試驗為9～13周。筆者認為培養(yǎng)時間不存在絕對性，主要與使用的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)基的pH值有關，目前使用的培養(yǎng)基均不夠理想，建議應加強副結核分枝桿菌培養(yǎng)基篩選和優(yōu)化方面的研究，應該有很大的提升空間。

遼寧省是遼寧絨山羊的主產(chǎn)區(qū)，飼養(yǎng)規(guī)模已超過300萬只，最新血清學調(diào)查結果顯示，遼寧絨山羊主產(chǎn)區(qū)副結核病的感染率已超過10%，本試驗進一步證實了遼寧地區(qū)絨山羊飼養(yǎng)場中副結核病的存在，建議相關部門應重視絨山羊副結核病的防控工作，保障遼寧絨山羊飼養(yǎng)業(yè)的健康發(fā)展。