何 波,李 飛,2,李凱瑞,張路瑤,3,趙 麗,4,劉永宏,4

(1.塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；3.巴里坤哈薩克自治縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆哈密 839200；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

羊蜱蠅(Melophagusovinus)是雙翅目、虱蠅科、蜱蠅屬一種無翅的體外吸血寄生蟲[1]，無平衡棒，體表呈革質(zhì)，密被細毛；頭部短小闊扁，無單眼，復(fù)眼小，觸角極短，具有刺吸式口器；胸部不分節(jié)，有3對足，末端有發(fā)達的爪及4對氣門；腹部不分節(jié)，雌蟲腹部大而圓,末端凹陷，雄蟲腹部小，末端凸出[2]。

綿羊通常被認(rèn)為是羊蜱蠅主要的終末宿主，但是羊蜱蠅已經(jīng)在一系列家養(yǎng)和野生動物甚至人上被發(fā)現(xiàn)，例如：山羊[3]、歐洲野牛[4]、紅狐[5]和人[6]等。羊蜱蠅寄生于綿羊時，宿主會因為叮咬引起痛癢不安和炎癥，繼而通過啃咬和摩擦體表來緩解羊蜱蠅帶來的刺激，最終導(dǎo)致羊毛脫落和皮膚損傷，增加綿羊皮膚蠅蛆病的感染風(fēng)險[7]，同時，被感染的羊會逐漸消瘦及羊毛生長緩慢[8]，從而造成經(jīng)濟損失。此外，羊蜱蠅還是多種病原體的傳播媒介，已被報道并證實的病原體有藍舌病病毒[9]、巴爾通氏體[10]、立克次氏體[11]、殺雄菌[12]、沃爾巴克氏體[12]、綿羊無漿體[13]、包柔氏螺旋體[14]以及羊錐蟲[1]等，因此對羊蜱蠅的研究具有積極意義。通過研究羊蜱蠅12S rDNA、16S rDNA和 18S rDNA基因，確定羊蜱蠅與其他綿羊體外寄生蟲在分子生物學(xué)上的區(qū)別。僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定羊蜱蠅可能會存在一定誤差，本研究從新疆南疆庫車縣某羊場收集羊蜱蠅，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對羊蜱蠅進行準(zhǔn)確鑒定，為蟲媒病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品 羊蜱蠅采自新疆南疆庫車縣某羊場綿羊體表，采集后立即送往塔里木大學(xué)畜牧科技重點實驗室，分別于離心管中-20 ℃保存和φ=75% 乙醇保存。

1.1.2 引物 參照文獻中的方法進行引物設(shè)計：12S rDNA基因采用通用引物12S-F和12S-R[15]，預(yù)期片段大小為320 bp；16S rDNA基因采用通用引物16S-F和16S-R[16],預(yù)期片段大小為455 bp； 18S rDNA基因引物參照GenBank中已登錄的羊蜱蠅 18S rDNA序列，應(yīng)用Primer premier 5.0進行設(shè)計,預(yù)期片段大小為619 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 引物序列信息Table 1 The sequence information of primers

1.1.3 主要試劑及儀器 TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(Code No.9765)、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)(Code No.R004A)和DL2000 DNA marker(Code No.3427A)，購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀(TC-5000，Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(R134a，Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY-12，購自北京市六一儀器廠)，凝膠成像儀(BIO-RADGelDocXR，購自美國博樂公司)。

1.2 方 法

1.2.1 羊蜱蠅的形態(tài)學(xué)鑒定 從乙醇中取出樣品，應(yīng)用體視顯微鏡觀察羊蜱蠅的頭、胸、腹、足、口器等形態(tài)特征，對羊蜱蠅進行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.2 羊蜱蠅DNA提取 于-20 ℃冰箱中取出樣品，蒸餾水漂洗 3 次后，按照TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書提取羊蜱蠅基因組DNA。

1.2.3 基因擴增及電泳 將所提取到的羊蜱蠅DNA為模板，分別擴增12S rDNA、16S rDNA和 18S rDNA基因片段，PCR擴增體系50 μL：基因組DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaq25 μL，雙蒸水22 μL。PCR反應(yīng)程序：12S rDNA為94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性15 s，51 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5個循環(huán)；94 ℃ 變性15 s，53 ℃ 退火30 s，70 ℃ 延伸30 s，25個循環(huán)；70 ℃ 延伸5 min。16S rDNA為94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，49 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5個循環(huán)；94 ℃ 變性30 s，47 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5個循環(huán)；94 ℃ 變性30 s，45 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，5個循環(huán)；94 ℃ 變性30 s，49 ℃ 退火30 s，68 ℃ 延伸30 s，25個循環(huán)；68 ℃ 延伸5 min。 18S rDNA為95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，57 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。擴增產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 序列分析 將測序結(jié)果進行Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)相似性比對，應(yīng)用MEGA 5.0的Clustal W進行核酸序列比對，進一步檢查對齊，計算遺傳距離，應(yīng)用鄰位相連法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

由圖1和圖2可知，羊蜱蠅無翅，體表呈革質(zhì)，密被細毛。體軀分為頭、胸、腹 3 部分，頭短而寬，與胸部緊密相連，具有刺吸式口器，胸部暗褐色，具有 3 對足，末端有粗壯的爪。雌性羊蜱蠅腹部大而圓，末端凹陷；雄性羊蜱蠅腹部較小而圓，末端有突出的長錐狀陰莖。

圖1 雌性羊蜱蠅腹面Fig.1 Ventral side of female Melophagusovinus

圖2 雄性羊蜱蠅腹面Fig.2 Ventral side of male Melophagusovinus

2.2 PCR擴增及測序

對形態(tài)學(xué)鑒定為羊蜱蠅的樣本(n=4)進行基因組DNA提取，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測均可得到目的條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖3)。測序共獲得羊蜱蠅12S rDNA序列2條、16S rDNA序列2條， 18S rDNA序列4條。結(jié)果上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，并獲得序列登錄號：MH102302、MH102303(12S rDNA)；MH102311、MH119054(16S rDNA)；MH119055-MH119058(18S rDNA)。

a：12S rDNA；b：16S rDNA；c：18S rDNA；M.DL2000 DNA marker；1～4.PCR產(chǎn)物 PCR products

2.3 系統(tǒng)進化與遺傳距離分析

2.3.1 12S rDNA序列分析 Blast結(jié)果發(fā)現(xiàn)：試驗獲得的序列與云南2016年上傳的羊蜱蠅序列(GenBank登錄號：KU664532.1)的相似性為100%，與日本2011年提交的鹿虱蠅序列的相似性為94%(GenBank登錄號：AB632589.1)。

2.3.2 16S rDNA序列分析 Blast結(jié)果發(fā)現(xiàn)：試驗所得序列與丹麥2007年、捷克2017年和新疆2017年提交的羊蜱蠅序列的相似性均為99%(GenBank登錄號分別EF531104.1、MF495941.1和KY224148.1)，與捷克2017年提交的頸利虱蠅和鹿虱蠅序列相似性分別為92%和91%(GenBank登錄號為MF495940.1和MF495939.1)。

從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取已知相應(yīng)虱蠅總科蠅類的基因序列，包括舌蠅科、虱蠅科和蛛虱蠅科，同時另選擇硬蜱和軟蜱基因序列各1條作為對照，利用MEGA 5.0軟件，基于K2P 遺傳距離用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖4可知，基于16S rDNA序列進化樹主要分為虱蠅總科和蜱，同時試驗所得樣品3和4與羊蜱蠅劃在同一小分支。經(jīng)計算，本試驗所獲得的羊蜱蠅序列和GenBank數(shù)據(jù)庫已知羊蜱蠅序列的種內(nèi)遺傳距離為0.7%～2.3%，與虱蠅科其他屬種的種間遺傳距離為10.1%～16.4%。種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離沒有交疊，結(jié)合NJ進化樹和遺傳距離分析，認(rèn)為16S rDNA序列可以用于羊蜱蠅的鑒定。

2.3.3 18S rDNA序列分析 Blast結(jié)果發(fā)現(xiàn)：試驗所得序列與新疆2016年提交的4條羊蜱蠅序列的相似性為99%(GenBank登錄號為KY224149.1、KX506727.1、KX506728.1和KX506729.1)，與捷克2000年提交的頸利虱蠅的相似性為98%(GenBank登錄號為AF322426.1)，與美國2012年和加拿大1998年提交的東非舌蠅和鳥虱蠅的相似性分別為97%和96%(GenBank登錄號分別為KC177312.1和AF073888.1)。

由圖5可知，進化樹主要分為 2 支：1支以虱蠅總科為主，1支以蜱為主，其中試驗所得羊蜱蠅樣品均與已知羊蜱蠅劃為一小支。經(jīng)計算，本試驗所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知羊蜱蠅序列的種內(nèi)遺傳距離為0，與虱蠅科其他屬種的種間遺傳距離為1.7%～9%。種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離沒有交疊，結(jié)合NJ進化樹和遺傳距離分析，認(rèn)為 18S rDNA序列可以用于羊蜱蠅的鑒定。

圖4 基于羊蜱蠅16S rDNA的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.4 NJ phylogenetic tree based on 16S rDNA of Melophagusovinus

圖5 基于羊蜱蠅 18S rDNA的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.5 NJ phylogenetic tree based on 18S rDNA of Melophagusovinus

3 討 論

羊蜱蠅地理分布廣，原產(chǎn)于歐洲大部分地區(qū)、非洲西北部、蒙古和印度北部，后引入到肯尼亞、南非、日本、澳大利亞、新西蘭和北美洲多數(shù)地區(qū)[11]。在中國，目前僅有新疆[10]、青海[17]、遼寧[18]、甘肅[2,12]等少數(shù)地區(qū)報道羊蜱蠅寄生于綿羊或藏羚羊；另外，山東[19]、浙江[20]等檢疫口岸在進口羊、羊皮和羊毛中檢出羊蜱蠅成蟲或蛹，存在傳播病原體的潛在危險。本試驗通過對羊蜱蠅的形態(tài)學(xué)初步鑒定和分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)新疆存在羊蜱蠅。

羊蜱蠅外觀與蜱相似，且關(guān)于羊蜱蠅形態(tài)學(xué)的報道相對較少，本試驗應(yīng)用體視顯微鏡對羊蜱蠅進行觀察，發(fā)現(xiàn)其特征與段德勇[2]關(guān)于綿羊虱蠅形態(tài)學(xué)的描述大體一致，但還是不能做出結(jié)論，因此采用分子生物學(xué)方法鑒定。相比于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，分子生物學(xué)鑒定易于操作，結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本試驗結(jié)果表明羊蜱蠅的 3 種基因序列均可以通過PCR測序獲得，16S rDNA和 18S rDNA已被廣泛用于生物的屬種鑒定[21]，例如：韓劍等[22]利用植原體16S rDNA對新疆阿克蘇地區(qū)和喀什地區(qū)的疑似棗瘋病植株做出準(zhǔn)確鑒定。相比于16S rDNA和 18S rDNA，羊蜱蠅12S rDNA基因很少被用于屬種的鑒定，但本試驗所獲得的 2 條12S rDNA基因序列與云南2016年提交的羊蜱蠅12S rDNA序列的相似性為100%，可以作為16S rDNA和 18S rDNA基因序列分析結(jié)果的一個補充，也為羊蜱蠅的分子生物學(xué)鑒定提供參考。

根據(jù)MEGA 5.0軟件的K2P 遺傳距離采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明基于16S rDNA和 18S rDNA基因序列的羊蜱蠅種內(nèi)和種間遺傳距離沒有交疊，其最小種間遺傳距離與最大種內(nèi)距離的差值分別為7.8%和1.7%，本試驗所用羊蜱蠅樣本能很好地與其他虱蠅科物種聚類，并且能與已知羊蜱蠅劃為同一小支。結(jié)果表明，基于12S rDNA、16S rDNA和 18S rDNA序列的分子生物學(xué)方法可以用羊蜱蠅的準(zhǔn)確鑒定，有助于掌握羊蜱蠅在國內(nèi)的種群分布，為防止?jié)撛诘牟≡w傳播奠定基礎(chǔ)。