言慧潔，潘源虎

（1.湖北省直屬機(jī)關(guān)醫(yī)院，湖北 武漢 430071；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技與動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430072）

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GCS）屬于類(lèi)固醇激素，是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的一類(lèi)甾體激素，臨床上常用于風(fēng)濕性及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮炎和某些感染類(lèi)疾病的綜合治療，療效較好，但使用不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，需在醫(yī)師指導(dǎo)下使用[1-6]。中藥制劑在治療和緩解類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病方面具有獨(dú)特的效果，諸如白芍總苷[7]、雷公藤多苷[8]等一批療效確切的中藥制劑已被廣泛應(yīng)用于臨床。一些不法商家為突顯產(chǎn)品療效，牟取暴利，在抗風(fēng)濕類(lèi)中藥制劑和保健品中非法添加GCS類(lèi)藥物[9-10]，長(zhǎng)期用藥會(huì)對(duì)患者造成潛在的健康和生命威脅。GCS類(lèi)藥物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[11-14]、毛細(xì)管色譜法[15-16]、薄層色譜法[17]、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[18]、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[19-21]等。本文建立了一種方法快捷、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS），用于檢測(cè)抗風(fēng)濕類(lèi)中藥制劑中非法添加的9種GCS類(lèi)化學(xué)藥品。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

API5000高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB/SCIEX公司）。

1.2 試劑與試藥

對(duì)照品：醋酸潑尼松（prednisone acetate 100012-201407）、醋酸潑尼松龍（prednisolone acetate 100124-201104）、 醋 酸 可 的 松（cortisone acetate 100123-201204）、醋酸氫化可的松（hydrocortisone acetate 100013-201408）、醋酸甲基潑尼松（meprednisone acetate 100828-201405）、醋酸地塞米松（dexamethasone acetate 100129-201504）、醋酸倍他米松（betamethasone acetate 100118-201204）、丙酸倍氯米松（beclomethasone dipropionate 100119-201504）；醋酸氟氫可的松（fiudrocortisones acetate 100009-201104），含量 ＞98%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。所用試劑均為色譜純，分析用水經(jīng)18.2 MΩ/cm處理。陰性樣品用抗風(fēng)濕中藥制劑復(fù)方風(fēng)濕寧膠囊（廣東羅浮山國(guó)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20060214，L16A091）。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1 液相色譜條件色譜柱 ：Venusil MP C18（2），2.1×150 mm，5 μm；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水，B為乙腈；柱溫40℃，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓3.0 kV，離子源溫度110℃，采用正離子（ESI+）掃描模式和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。GCS類(lèi)藥物選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)的優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液分別精密稱(chēng)取9種對(duì)照品約10 mg，置10 mL容量瓶中，分別用乙腈溶解后定容至刻度，做為對(duì)照品儲(chǔ)備液（1 mg/mL），置于-20℃冰箱中，待檢。再精密量取各對(duì)照品溶液適量，配制成含醋酸潑尼松、醋酸可的松、醋酸氫化可的松各2 μg/mL，醋酸地塞米松、醋酸倍他米松、醋酸潑尼松龍、醋酸甲基潑尼松、醋酸氟氫可的松各1 μg/mL、丙酸倍氯米松0.5 μg/mL的高質(zhì)量濃度對(duì)照品混合溶液；精密量取該高質(zhì)量濃度對(duì)照品混合溶液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，用初始流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得較低質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 樣品溶液取適量復(fù)方風(fēng)濕寧膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，稱(chēng)取0.5 g（準(zhǔn)確至0.1 mg），置于100 mL量瓶中，加入乙腈80 mL，超聲提取30 min，放冷至室溫，加乙腈定容至刻度，搖勻后過(guò)濾，取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm濾膜，即為陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性取“2.2”項(xiàng)下低濃度混合對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液各5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄圖譜。9種GCS類(lèi)藥物的混合對(duì)照品溶液提取離子流圖見(jiàn)圖1，各目標(biāo)化合物的保留時(shí)間見(jiàn)表2。

2.3.2 線性范圍和檢測(cè)限分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下高質(zhì)量濃度對(duì)照品混合溶液0.2，0.5，1，2，4，6，10 mL于25 mL的量瓶中，用初始流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液，分別過(guò)0.22 μm的濾膜。精密量取5 μL進(jìn)樣，記錄圖譜，將峰面積（A）與其相對(duì)應(yīng)的組分質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸。按信噪比（S/N）為3時(shí)計(jì)算9種GCS類(lèi)非法添加物的檢測(cè)限；按S/N為10時(shí)計(jì)算9種GCS類(lèi)非法添加物的定量限。見(jiàn)表3。

表2 9種GCS的保留時(shí)間及質(zhì)譜采集參數(shù)

圖1 9種GCS類(lèi)藥物提取離子色譜圖

2.3.3 精密度試驗(yàn)精密量取“2.2.1”項(xiàng)下低質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液5 μL，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣，連續(xù)重復(fù)6次，記錄圖譜，按峰面積計(jì)算RSD，各成分的RSD（n=6）分別為：醋酸潑尼松0.61%、醋酸可的松0.75%、醋酸潑尼松龍0.56%、醋酸氫化可的松0.49%、醋酸甲基潑尼松1.29%、醋酸地塞米松0.68%、醋酸倍他米松0.59%、醋酸倍氯米松1.12%、醋酸氟氫可的松0.95%。

2.3.4 加樣回收率精密稱(chēng)取3份陰性樣品各0.5 g，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下高質(zhì)量濃度對(duì)照品混合溶液1，5，10 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成含有9種GCS藥物低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平的溶液，每個(gè)濃度平行6次。按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣5 μL，記錄圖譜，測(cè)定各樣品中藥物含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4，9種GCS類(lèi)藥物在低、中、高3個(gè)濃度水平上測(cè)得的平均回收率為89.5%～112.6%，RSD＜8.3%。

表3 9種GCS類(lèi)藥物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）

表4 9種GCS類(lèi)藥物的加樣回收率

2.3.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.3.4”項(xiàng)下添加高質(zhì)量濃度水平的溶液，分別在0，6，12，24，48 h時(shí)取樣，按實(shí)驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄圖譜。結(jié)果9種GCS類(lèi)藥物的峰面積測(cè)定值的RSD均＜5.8%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于中藥成分復(fù)雜，在GCS類(lèi)非法添加物劑量不確定的情況下，基質(zhì)干擾大，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，給檢測(cè)工作帶來(lái)難度。本文通過(guò)比較陰性樣品溶液和對(duì)照品溶液的液質(zhì)圖譜，未發(fā)現(xiàn)干擾9種GCS類(lèi)藥物的色譜峰，表明建立的方法專(zhuān)屬性良好。本實(shí)驗(yàn)采用MRM模式提高了檢測(cè)靈敏度，但是由于醋酸地塞米松和醋酸倍他米松是同分異構(gòu)體，僅僅在16位的-CH3的構(gòu)型不同（地塞米松是α構(gòu)型，倍他米松是β構(gòu)型），它們?cè)谫|(zhì)譜中分離出的母離子和碎片子離子完全相同。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，選擇使用乙腈、0.1%甲酸-水梯度洗脫，以提高醋酸地塞米松和醋酸倍他米松的色譜分離度，滿足定量需要。有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)流動(dòng)相中甲酸含量為0.05%～0.1%時(shí)，隨著甲酸含量的增加，GCS的響應(yīng)值逐漸增加，并且醋酸地塞米松和醋酸倍他米松的分離效果良好。同時(shí)流動(dòng)相中加入甲酸能增強(qiáng)被測(cè)物質(zhì)的電離效果，且能改善色譜峰拖尾現(xiàn)象[22]。

3.2 9種GCS類(lèi)藥物的質(zhì)譜行為

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果表明，在ESI模式下，GCS的質(zhì)譜響應(yīng)靈敏度較高。質(zhì)譜斷裂方式有如下規(guī)律：含有氟的化合物在二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)，產(chǎn)生豐度較高的[M-HF]+離子（M-20），如醋酸地塞米松、醋酸倍他米松、醋酸氟氫可的松；醋酸酯的GCS類(lèi)藥物，在二級(jí)質(zhì)譜碎片中，還容易產(chǎn)生脫[M-CH3COOH]+的特征碎片離子（M-60），如本研究中的醋酸潑尼松、醋酸潑尼松龍和醋酸可的松。由于此類(lèi)甾體激素結(jié)構(gòu)中含有羥基，在進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)，均能產(chǎn)生脫水的碎片離子。這些特征碎片離子可以作為其特征的例子對(duì)樣品中此類(lèi)甾體激素進(jìn)行定性分析，也可以選擇作為定量的離子。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究建立了抗風(fēng)濕中藥制劑中可能非法添加的9種GCS的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法。本方法樣品處理簡(jiǎn)單，專(zhuān)屬性、精密度、回收率高，可作為抗風(fēng)濕中藥制劑或保健品中非法添加糖皮質(zhì)激素的監(jiān)督檢測(cè)方法。