李 婕， 劉遠(yuǎn)新， 陳軍虎， 王新亭， 沙迪克·買合不熱提， 茹克亞

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元退行性病變?yōu)橹饕±硖卣鞯闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)退行性疾病，僅次于阿爾茨海默病成為第二大老年退行性疾病。震顫、肌強(qiáng)直及運(yùn)動(dòng)減少為該病的主要臨床表現(xiàn)，本病病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主要考慮與遺傳、環(huán)境、飲食、年齡[1，2]等因素有關(guān)。主要的發(fā)病機(jī)制為線粒體功能紊亂[3]、神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激[4]等。而當(dāng)前就帕金森病與興奮性氨基酸相關(guān)性研究是國(guó)際研究熱點(diǎn)之一，主要集中在谷氨酸、天門冬氨酸等對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞興奮性毒性以及抑制性氨基酸中最為重要的遞質(zhì)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)在患者腦組織中含量變化等方面上[5，6]。然而就人體生長(zhǎng)所必需的參與蛋白質(zhì)構(gòu)成的氨基酸與本病的關(guān)系卻研究甚少。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究對(duì)象均來(lái)自新疆各地州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2012～2016年收治的門診或住院帕金森病患者共960例，其中漢族帕金森病患者168例，對(duì)照組198例，維族帕金森病患者144例，對(duì)照組181例，哈族帕金森病患者108例，對(duì)照組161例，對(duì)照組為同期各地州醫(yī)院體檢中心以及其他科室收住人員，每一位對(duì)照組患者為隨機(jī)抽取，與病例組年齡(±3歲)、族別、性別、職業(yè)、文化程度與PD患者相匹配的無(wú)帕金森病的符合本研究對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)者，在經(jīng)患者本人同意后納入研究。

1.2 研究方法

1.2.1 采集方法 研究對(duì)象均于入院空腹10 h后，次日晨抽空腹肘靜脈血2 ml，置于促凝管中，于室內(nèi)常溫下以3000 r/min的速率離心15～20 min，將血清置于EP管中-80 ℃冰箱內(nèi)保存，待測(cè)。

1.2.2 樣品處理 定性分析8種必需氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：在玻璃試管中依次加入1 ml乙腈，500 μl無(wú)水乙醇，5 μl內(nèi)標(biāo)，然后加入500 μl血清；用漩渦混勻器混勻1 min，然后以 3000 r/min 的速率離心10 min，取上清液與另一試管內(nèi)；加入20 μl氫氧化鈉溶液使其堿化；加入1000 μl正己烷萃取兩次；加入50 μl氯甲酸乙酯、100 μl 吡啶后混勻30 s釋放CO2；加入氯仿625 μl，緩沖溶液1.25 ml，加蓋混勻2 min，靜止至上層液澄清；吸取下層液，并加入約5 μl無(wú)水硫酸鈉，靜止30 s；吸取液體移入EP管中，在氮吹儀下濃縮至80～100 μl，進(jìn)行進(jìn)樣分析。

1.2.3 色譜條件 選用 GC6890氣象色譜儀，色譜柱為 DB-17MS，前檢測(cè)器尾吹氣流量15 ml/min，前進(jìn)樣口總流量18.4 ml/min，前進(jìn)樣口壓力90 kPa，前進(jìn)樣口溫度、柱箱溫度 280 ℃，前檢測(cè)器氮?dú)饬髁?0 ml/min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所收集數(shù)據(jù)通過(guò)Excel錄入建立數(shù)據(jù)庫(kù)，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；多組計(jì)量資料比較前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若符合方差齊性，采用單因素方差分析方法進(jìn)行組間兩兩比較，并以LSD法行多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05；若方差不齊性，采用Games-Howell近似檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 必需氨基酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的人體8種必需氨基酸(纈氨酸Val、亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile、蘇氨酸Thr、甲硫氨酸Met、苯丙氨酸Phe、賴氨酸Lsy、色氨酸Trp)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(見(jiàn)圖1)；8種必需氨基酸在氣相下的保留時(shí)間、峰面積、內(nèi)標(biāo)面積及標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/內(nèi)表面積(=該氨基酸的血清相對(duì)含量)(見(jiàn)表1)。

2.2 不同民族病例組與對(duì)照組必須氨基酸含量比較

2.2.1 漢族病例組于對(duì)照組8種必需氨基酸含量比較 見(jiàn)表2。此次所收集病例中，漢族病例組168例，對(duì)照組198例，比較兩組必須氨基酸含量，可得出兩組在纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、色氨酸含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余血清必需氨基酸P>0.05。

2.2.2 維吾爾族病例組與對(duì)照組8種必需氨基酸含量比較 見(jiàn)表3。此次所收集病例中，維吾爾族病例組144例，對(duì)照組181例，比較兩組必須氨基酸含量，可得出兩組在異亮氨酸、甲硫氨酸的含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余血清必需氨基酸P>0.05。

2.2.3 哈族病例組與對(duì)照組8種必需氨基酸含量比較 見(jiàn)表4。此次所收集病例中，哈族病例組108例，對(duì)照組161例，比較兩組必須氨基酸含量，可得出兩組在纈氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余血清必需氨基酸P>0.05。

2.2.4 3個(gè)民族對(duì)照組8種必需氨基酸含量的比較 見(jiàn)表5。

2.2.5 3個(gè)民族病例組8種必需氨基酸含量的比較 見(jiàn)表6。

圖1 8種必需氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

氨基酸保留時(shí)間峰面積內(nèi)標(biāo)面積標(biāo)準(zhǔn)品面積/內(nèi)標(biāo)面積纈氨酸亮氨酸異亮氨酸蘇氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸賴氨酸色氨酸內(nèi)標(biāo)10.88411.72311.91612.84615.48416.75421.41325.36618.8844.65690.55538.31750.03480.14565.047183.511208.249113.282136.16899.047144.361153.46370.65727.83619.3370.3940.6650.3870.3470.5220.9216.59310.769

注：標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/內(nèi)標(biāo)面積=該氨基酸的血清相對(duì)含量

表2 漢族病例組與對(duì)照組在8種必須氨基酸含量比較

表3 維吾爾族病例組與對(duì)照組在8種必須氨基酸含量比較

表4 哈族病例組與對(duì)照組在8種必須氨基酸含量比較

表5 3個(gè)民族對(duì)照組在8種必須氨基酸含量的比較

注：兩兩比較中，亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、色氨酸含量均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

表6 3個(gè)民族病例組在8種必須氨基酸含量的比較

注：兩兩比較中，色氨酸含量均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

3 討 論

氨基酸在人體生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中起著不可或缺的作用。自然界中已發(fā)現(xiàn)的天然氨基酸多達(dá)300余種，而人體生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中參與蛋白質(zhì)構(gòu)成的僅有22種。按照人體自身合成能力可以分為非必需氨基酸、條件必需氨基酸及必需氨基酸，那些人體自身不能合成或合成速度遠(yuǎn)不能適應(yīng)機(jī)體代謝需要我們稱之為必需氨基酸，包括異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸。必需氨基酸是合成生物大分子蛋白質(zhì)、參與機(jī)體新陳代謝，促進(jìn)生命穩(wěn)態(tài)所必須的。人體內(nèi)的任何一種必需氨基酸都只能以一定的數(shù)量和比例參與生物活動(dòng)，過(guò)量或不足均會(huì)造成人體所需氨基酸之間失衡，甚至?xí)a(chǎn)生體內(nèi)負(fù)氮平衡，長(zhǎng)期的氨基酸失衡飲食會(huì)影響到營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)合成、機(jī)體的生理機(jī)能，導(dǎo)致代謝紊亂、抵抗力下降等[7，8]。新疆自古以來(lái)就是多民族聚居地方，前三大民族分別為漢、維、哈族，3個(gè)民族自古以來(lái)就有著不同的民族風(fēng)俗、飲食居住習(xí)慣。劉燕等[9]就新疆地區(qū)不同民族間帕金森病患病率的流行病學(xué)調(diào)查研究中得出，新疆喀什地區(qū)6229例55歲以上的漢族、維吾爾族中老年人調(diào)查結(jié)果顯示，調(diào)查人群中漢族的PD患病率為0.7%(21/2871)，維吾爾族的PD患病率為1.1%(36/3274)。而楊新玲等[10]對(duì)伊犁地區(qū)5113例進(jìn)行流行病學(xué)問(wèn)卷調(diào)查，其中總患病率為1.2%，其中哈族、漢族和維族PD患病率為1.2%、1.1%和1.5%。因此檢測(cè)漢、 維、哈族帕金森病患者血清必需氨基酸含量對(duì)臨床和科研等都具有重要意義。

此次試驗(yàn)可得出，3個(gè)民族的病例組與對(duì)照組在甲硫氨酸含量上均有差異，而3個(gè)民族病例組在八種必須氨基酸含量的比較來(lái)看兩兩比較色氨酸含量的差異均有意義。

甲硫氨酸(methionine，Met)是一種人體必需氨基酸，即人體自身不能合成，只能通過(guò)食用動(dòng)植物類蛋白由外界間接獲得。甲硫氨酸在維持人體生長(zhǎng)發(fā)育方面起著不可或缺的重要作用，同時(shí)他還具抗氧化作用[11，12]。而其中間代謝產(chǎn)物同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)與本病的關(guān)系，較多研究認(rèn)為PD患者擁有較高的高同型半胱氨酸，但在后來(lái)的研究中人們逐漸認(rèn)識(shí)到PD患者血漿同型半胱氨酸水平升高可能為左旋多巴在體內(nèi)代謝所致[13，14]. Yasui等對(duì)20例日本籍PD患者在接受左旋多巴治療前后tHcy水平的研究中，同時(shí)測(cè)定其MTHFR基因型，研究結(jié)果提示左旋多巴治療后患者血漿Hcy水平有明顯升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)患者 Hcy 升高的程度與 MTHFR 基因型有關(guān)，因此有理由認(rèn)為帕金森病患者血漿同型半胱氨酸水平過(guò)高是服用左旋多巴藥物所引起的，而MIHFR基因型會(huì)影響其升高的水平[15]。而體內(nèi)甲硫氨酸含量的銳減可導(dǎo)致機(jī)體激素、神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白質(zhì)等因缺乏甲基而間接導(dǎo)致了帕金森病患者諸如抑郁、便秘等某些臨床不適兼癥。此次研究可看出3個(gè)民族病例組甲硫氨酸檢測(cè)水平明顯低于對(duì)照組，可得出甲流氨酸的減少是該病發(fā)生發(fā)展的因素之一，也提示帕金森病患者在飲食上要注意補(bǔ)充適量甲硫氨酸。

色氨酸(Tryptophan，TRP)是一種人體必需氨基酸，在體內(nèi)主要經(jīng)犬尿氨酸(kynurenine，KYN)途徑代謝，其中間產(chǎn)物KYN的主要代謝產(chǎn)物犬尿喹啉酸(kynurenic acid，KYNA)對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能有重要作用。TRP 在血漿中以游離和結(jié)合形式存在，一般情況下，兩種形式的 TRP 處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。血漿游離 TRP 和支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)濃度參與調(diào)解腦內(nèi)TRP 濃度，當(dāng)血漿游離TRP濃度升高時(shí)，進(jìn)入腦內(nèi)的TRP則增多，腦內(nèi)KYN代謝通路活化增強(qiáng)[16]。生理情況下，外周血中TRP 和KYN可通過(guò)神經(jīng)源性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入腦組織，KYNA分子因極性強(qiáng)難以通過(guò)血腦屏障，但血清KYNA的濃度變化可通過(guò)TRP和KYN影響腦內(nèi)KYNA的水平[17]。

本次研究發(fā)現(xiàn)漢族、哈族病例組色氨酸含量低于對(duì)照組(P<0.05)，而三民族病例組間色氨酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合上述色氨酸與帕金森病相關(guān)研究報(bào)道，推測(cè)可能由于患者在以往日常生活中色氨酸攝入過(guò)少、過(guò)度消耗代謝酶類異常等導(dǎo)致血清色氨酸水平下降，進(jìn)而影響正常KYN代謝途徑，進(jìn)入腦內(nèi)的TRP、 KYN 過(guò)少使得腦內(nèi) KYNA 水平降低，病理性的易化EAA受體的活化，引起神經(jīng)元鈣超載和多種破壞性酶類的激活以及活性氧簇的大量產(chǎn)生、PD患者黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性壞死及相應(yīng)腦區(qū) DA 水平降低等，從而引發(fā)或進(jìn)一步加重PD。在接下來(lái)的研究中可以通過(guò)檢測(cè)患者血清 KYN、KYNA 含量，間接了解患者血清TRP代謝情況。

奶制品中的色氨酸是人體8種必需氨基酸之一，牛奶中的L-色氨酸是大腦合成5-羥色胺的主要原料，而五羥色胺能使大腦思維活動(dòng)暫時(shí)受到抑制，它不僅有抑制大腦興奮的作用，還有鎮(zhèn)靜作用，能夠使人產(chǎn)生疲倦的感覺(jué)。在2010年4月11日的“帕金森病日”上，整個(gè)協(xié)會(huì)帕金森病患者的“少喝牛奶、多食肉食、海鮮，適量飲茶、咖啡，蛋白質(zhì)攝入重新分配”的飲食原則，給本病患者及家屬在飲食上提出了相應(yīng)的飲食指導(dǎo)意見(jiàn)[18]。由于維吾爾族及哈族均為游牧民族，歷代以來(lái)生活中喜飲牛、羊、馬、駱駝奶等鮮乳制品，而奶茶等成為他們每頓餐桌上不可缺少的飲品，此外少數(shù)民族生活中還將鮮乳制品制作成酸奶、奶皮子、酸奶疙瘩、酥油、奶酪等乳制品，是每個(gè)維吾爾族及哈薩克族人平素生活中不可或缺的進(jìn)食物質(zhì)。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也可看出，維吾爾族及哈族帕金森患者血清中色氨酸量均較漢族偏高，且這種差異有意義，這也提示帕金森病患者在飲食上要注意適量控制色氨酸攝入量。