嚴(yán) 穎 朱肖鴻 傅淑艷 陳丹丹 凌紅羽

作者單位：浙江省中醫(yī)院下沙院區(qū)感染科（杭州 310018）

乙型肝炎病毒感染呈世界性流行，據(jù)世衛(wèi)組織報道，全球約20億人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中 2.4 億為慢性 HBV 感染者[1]，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細胞癌[2]，嚴(yán)重威脅人類健康，是一個全球性的健康問題[3]。我國約有1.5億HBV攜帶者[4]。HBV感染的擴散主要由無癥狀攜帶者所致。宿主的細胞免疫功能狀況是影響HBV攜帶的一個非常重要的因素。研究[5]表明，乙型肝炎病毒感染后HBV特異性T淋巴細胞亞群在對病毒的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用。本研究通過分析四種常見中醫(yī)證型的患者不同性別、年齡、乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（hepatitis B virus DNA，HBVDNA）載量和乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）水平和 T細胞亞群變化的規(guī)律，了解其對T細胞免疫功能的影響，為慢性乙型肝炎病毒攜帶者的特異性免疫和中醫(yī)治未病干預(yù)治療提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年7月—2017年10月浙江省中醫(yī)院肝病門診就診，確診為慢性乙型肝炎病毒攜帶者110例，男58例，女52例，年齡15～65歲，平均（33.66±9.77）歲。另選擇同期體檢合格的健康人20名為對照組，其中男12名，女8名，年齡20～59歲，平均（34.20±10.82）歲，均無肝炎病史、乙型肝炎標(biāo)志物測定陰性，肝功能正常。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合《慢性乙型肝炎防治指南》[2]（2015版）中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行診斷，符合以下兩條中的一條即可診斷：（1）慢性HBV攜帶者：多為年齡較輕的處于免疫耐受期的HBsAg（hepatitis B s antigen，乙型肝炎s抗原）、HBeAg、HBVDNA陽性者，1年內(nèi)連續(xù)3次隨訪，每次間隔至少3個月，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）均在正常范圍，HBVDNA通常為高水平，肝組織檢查無病變或者病變輕。（2）非活動性HBsAg攜帶者：血清HBsAg陽性、HBeAg陰性，HBVDNA低于檢測下限或者＜200IU/mL，1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次及以上，每次至少間隔3個月，ALT均在正常范圍內(nèi)。肝組織學(xué)檢查提示組織活動指數(shù)＜4或根據(jù)其他的半定量計分系統(tǒng)判定病變輕微。本研究遵循倫理委員會要求，開展臨床研究，所有患者均自愿參加該研究，并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并感染甲、丙、丁、戊型肝炎，和/或感染人類免疫缺陷病毒；（2）有除外病毒性肝炎的慢性肝病史或慢性肝病相關(guān)的臨床情況（如色素沉著病、自身免疫性肝炎、代謝性肝臟疾病、酒精性肝病、中毒性肝病、地中海貧血等）；（3）入選前的6個月內(nèi)有服用非法藥品史或濫用酒精史（每天飲酒超過30g的女性和男性）；（4）有肝細胞癌、肝硬化或血清甲胎蛋白升高者；（5）有心腦血管等其他嚴(yán)重疾病的證據(jù)的；（6）懷孕或哺乳期婦女；⑧有精神疾患者。

1.4 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》[6]，由兩名具有高級職稱的中醫(yī)師進行中醫(yī)證候分型。本研究所選慢性乙型肝炎病毒攜帶者常見四種中醫(yī)證型為脾氣虛證、肝氣郁結(jié)證、濕熱中阻證、腎氣虛證。

1.5 研究方法

1.5.1 T淋巴細胞亞群檢測 所有受試者采集空腹靜脈血5mL，采用流式細胞分析技術(shù)檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞百分率及CD4+/CD8+比值。

1.5.2 血清乙肝三系檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 技術(shù)測定 HBsAg、HBeAg、HBeAb（hepatitis B e antibody，乙型肝炎e抗體）滴度，據(jù)此將患者分為 HBeAg（+）組和 HBeAg（-）組。

1.5.3 血清HBVDNA檢測 采用實時熒光定量PCR檢法（FQD-33A型）檢測血清HBVDNA載量，操作嚴(yán)格按試劑盒使用說明進行。最低檢測下限值為（1.00E+02）IU/mL，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：＜102IU/mL 為陰性組，102～105IU/mL 為低載量組，105～107IU/mL 為中載量組，＞107IU/mL為高載量組。

1.5.4 相關(guān)分析 分析患者HBeAg、HBVDNA滴度及性別、年齡、中醫(yī)證型與T淋巴細胞亞群的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均值用方差分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證型分布 本組110例患者常見中醫(yī)證型為脾氣虛證31例（28.18%），肝氣郁結(jié)證42例（38.18%），濕熱中阻證22例（20.00%），腎氣虛證15例（13.64%），以氣虛證為常見，其次依次為肝氣郁結(jié)證、濕熱中阻證。

2.2 慢性HBV攜帶者T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果

與健康對照組比較，慢性HBV攜帶者外周血CD4+T淋巴細胞百分率及CD4+/CD8+比值水平顯著降低（P＜0.01）；CD8+T淋巴細胞百分率則顯著升高（P＜0.01），見表 1。

表1 慢性HBV攜帶者外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

表1 慢性HBV攜帶者外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.01

組別慢性HBV攜帶組健康對照組例數(shù)110 20 CD4+35.41±7.18*46.27±3.29 CD8+24.89±5.50*20.29±1.51 CD4+/CD8+1.52±0.54*2.30±0.27

2.3 不同中醫(yī)證型外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果

四種證型CD4+T細胞百分率、CD4+/CD8+比值均較健康對照組降低（P＜0.05），依濕熱中阻證—肝氣郁結(jié)證—脾氣虛證—腎氣虛證順序，呈逐漸降低趨勢；脾氣虛證、腎氣虛證外周血CD8+T細胞百分率較健康對照組升高（P＜0.05）。脾氣虛證和腎氣虛證組CD4+T細胞百分率、CD4+/CD8+比值較濕熱中阻證組明顯降低（P＜0.01）。見表 2。

2.4 慢性HBV攜帶者不同HBeAg滴度T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果 HBeAg陽性組與HBeAg陰性組比較，患者CD4+T淋巴細胞百分率及CD4+/CD8+比值水平顯著降低，CD8+T淋巴細胞百分率則顯著升高（P＜0.05）。見表 3。

表2 不同中醫(yī)證型患者外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

表2 不同中醫(yī)證型患者外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與濕熱中阻證比較，△P＜0.01

中醫(yī)證型脾氣虛肝氣郁結(jié)濕熱中阻腎氣虛健康對照組例數(shù)31 42 22 15 20 CD4+29.91±2.35*△37.97±1.80*45.38±3.58*24.97±1.26*△46.27±3.29 CD8+26.82±5.08*△23.03±4.01 21.52±3.47 31.07±6.10*△21.29±1.51 CD4+/CD8+1.17±0.3*△1.70±0.31*2.16±0.38*0.84±0.24*△2.30±0.27

表3 慢性HBV攜帶者不同HBeAg滴度外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

表3 慢性HBV攜帶者不同HBeAg滴度外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與 HBeAg陰性組比較，▲P＜0.05

組別HBeAg陽性組HBeAg陰性組健康對照組例數(shù)27 83 20 CD4+28.66±5.60▲37.60±6.23*46.27±3.29 CD8+29.80±5.73▲23.29±4.39*20.29±1.51 CD4+/CD8+1.04±0.46▲1.68±0.45*2.30±0.27

2.5 不同HBV-DNA載量患者T淋巴細胞亞群比較 HBV-DNA（+）與 HBV-DNA（-）組比較，CD4+T淋巴細胞百分率及CD4+/CD8+比值顯著降低，CD8+T淋巴細胞百分率顯著升高。隨著HBV病毒載量的升高，CD4+T淋巴細胞百分率及CD4+/CD8+比值逐漸下降，CD8+T淋巴細胞百分率逐漸升高（P＜0.05），見表4。

表4 慢性HBV攜帶者不同HBVDNA載量外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

表4 慢性HBV攜帶者不同HBVDNA載量外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.05；與陰性組比較，▽P＜0.05；與低載量組比較，▼P＜0.05；結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBVDNA＜102IU/mL 為陰性組，102～105IU/mL為低載量組，105～107IU/mL為中載量組，＞107IU/mL為高載量組

組別健康對照組陰性組低載量組中載量組高載量組例數(shù)20 56 31 6 17 CD4+46.27±3.29 38.64±5,18 35.26±7.31*▽29.28±3.18*▽▼27.18±5.78*▽▼CD8+20.29±1.51 21.89±3.64 25.93±4.42*▽30.04±5.99*▽▼31.06±5.31*▽▼CD4+/CD8+2.30±0.27 1.81±0.39 1.42±0.48*▽1.03±0.35*▽▼0.94±0.47*▽▼

2.6 慢性HBV攜帶者不同性別T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果 慢性HBV攜帶者不同性別，男性組與女性組比較，CD4+T淋巴細胞百分率、CD8+T淋巴細胞百分率及CD4+/CD8+比值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 5。

2.7 慢性HBV攜帶者不同年齡組T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果 慢性HBV攜帶者不同年齡組，男性組與女性組比較，CD4+T淋巴細胞百分率及CD4+/CD8+比值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），CD8+T淋巴細胞百分率，≤30歲組明顯高于＞30歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 6。

表5 慢性HBV攜帶者不同性別T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

表5 慢性HBV攜帶者不同性別T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

組別男性組女性組例數(shù)58 52 CD4+34.73±7.12 36.16±7.24 CD8+25.42±5.32 24.30±5.68 CD4+/CD8+1.45±0.47 1.61±0.60

表6 慢性HBV攜帶者不同年齡T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

表6 慢性HBV攜帶者不同年齡T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果（%，±s）

注：與 31～45歲組、≥46歲組比較，☆P＜0.05

年齡≤30歲31～45 歲≥46歲例數(shù)46 51 13 CD4+34.19±7.38 36.24±7.35 36.46±5.43 CD8+26.43±5.63☆24.02±5.26 22.83±4.80 CD4+/CD8+1.39±0.53 1.61±0.55 1.67±0.48

3 討論

乙型肝炎病毒通過宿主自身免疫反應(yīng)造成肝細胞的損傷。HBV感染誘導(dǎo)機體形成慢性化感染、持續(xù)性耐受和激活特異性免疫應(yīng)答。研究[7]表明，HBV特異性T淋巴細胞亞群在對病毒的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用。CD4+T淋巴細胞通過輔助體液免疫細胞，產(chǎn)生抗體和細胞毒性殺傷作用來清除HBV，其水平下降是HBV感染慢性化的重要原因。CD8+T淋巴細胞是清除HBV的主要效應(yīng)T細胞，有直接被HBV感染肝細胞激活的特性，免疫耐受期HBV病毒不斷復(fù)制，引起CD8+T淋巴細胞的細胞毒作用隨病毒水平的增高而增強。二者相互影響，平衡機體免疫狀態(tài)，當(dāng)兩者數(shù)目發(fā)生變化時，導(dǎo)致細胞免疫功能下降和免疫調(diào)節(jié)失衡。慢性HBV感染者體內(nèi)T淋巴細胞亞群失衡主要由CD8+T淋巴細胞比例升高、CD4+T淋巴細胞比例下降引起，并且和HBVDNA復(fù)制有關(guān)，HBVDNA復(fù)制、高HBeAg表達時可進一步導(dǎo)致乙肝患者細胞免疫功能紊亂[8]。

中醫(yī)認(rèn)為，該病形成是由濕熱疫毒隱伏，正氣不能抗邪所致，屬于中醫(yī)正虛邪不盛。病變不僅涉及肝，且多克脾、累腎[9]。濕熱疫毒入侵機體，傷及肝臟，繼則肝病傳脾，肝脾同病，印證“見肝之病，知肝傳脾”的理論。久則病情由實轉(zhuǎn)虛，病位由淺入深，肝腎同源，必將傷腎。本研究四種證候出現(xiàn)在腎、肝、脾三臟，且以氣虛證為主，也與其發(fā)病機制相吻合。機體的正氣與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫系統(tǒng)功能有密切聯(lián)系，正氣不足表現(xiàn)為免疫功能低下或失常。

本研究顯示，四種證型攜帶者CD4+T細胞百分率、CD4+/CD8+比值較健康對照組降低，依濕熱中阻證-肝氣郁結(jié)證-脾氣虛證-腎氣虛證順序，呈逐漸降低趨勢，提示此四種證型患者均存在一定程度的免疫紊亂或低下。脾氣虛證和腎氣虛證組較濕熱中阻證組CD4+T細胞百分率、CD4+/CD8+比值明顯降低，提示氣虛證患者細胞免疫功能相對更加低下，故氣虛證攜帶者在臨床上治療時宜重用補脾益肝腎藥物，以提高機體免疫功能，促進疾病的恢復(fù)[10]。濕熱中阻證患者CD4+T細胞百分率和CD4+/CD8+值雖較健康對照組下降不明顯，提示該人群正氣并未衰敗，免疫應(yīng)答沒有明顯減弱，正氣旺而邪氣盛，可能存在炎癥反應(yīng)增強。因此，濕熱中阻證人群更容易發(fā)生炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)肝組織損傷[11]，故在免疫調(diào)節(jié)治療基礎(chǔ)上應(yīng)加重清熱解毒利濕藥物的早期干預(yù)。

本研究結(jié)果還顯示，慢性HBV攜帶者不同性別，T淋巴細胞亞群檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同年齡組，≤30歲組患者CD8+T淋巴細胞百分率明顯高于＞30歲組（P＜0.05）表明青壯年時期往往處于乙型肝炎病毒感染的免疫耐受期，HBV病毒不斷復(fù)制、病毒抗原的持續(xù)存在導(dǎo)致CD8+T淋巴細胞數(shù)量增多。與健康對照組相比，慢性乙型肝炎病毒攜帶者的CD4+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值明顯降低（P＜0.01）。HBVDNA（+）組與 HBVDNA（-）組比較，HBeAg（+）和 HBeAg（-）比較，CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值下降、CD8+T淋巴細胞百分比增高（P＜0.05），提示患者T細胞亞群改變不僅與HBV感染有關(guān)，也與HBVDNA復(fù)制程度有關(guān)。HBVDNA復(fù)制增加，可能進一步導(dǎo)致患者細胞免疫功能紊亂。乙型肝炎病毒攜帶者在長期受到HBV感染的情況下，T淋巴細胞發(fā)生免疫耐受或啟動凋亡程序,T淋巴細胞的激活變?yōu)橐种菩?yīng)[12]，導(dǎo)致體內(nèi)細胞免疫功能低下,這也可能是病毒持續(xù)存在而導(dǎo)致感染慢性化的原因之一。

綜上,慢性乙型肝炎病毒攜帶者細胞免疫功能發(fā)生變化，因此臨床上可根據(jù)患者不同年齡、HBVDNA載量、HBeAg滴度變化來了解慢性乙型肝炎病毒攜帶者的免疫功能。通過中醫(yī)辯證分析，判定當(dāng)病證由實轉(zhuǎn)虛的過程中，往往會出現(xiàn)細胞免疫功能的紊亂或下降。CD4+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值，可作為判定病情輕重程度的一個重要指標(biāo)。在臨床上，我們可以通過抑制HBV復(fù)制、中醫(yī)扶正祛邪法來改善機體的細胞免疫功能,提高機體對HBV清除的能力，從而遏制疾病的進展。