申重陽，幸倚帆，譚小虎，陳勇軍

（1.成都中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，四川 成都 611137；2.成都康景生物科技有限公司，四川 成都 611130）

自然殺傷細胞（natural killer cell, NK）是機體重要的免疫細胞，約占外周血單個核細胞總數(shù)的10%～20%，主要分布在外周血、淋巴結、脾、骨髓中，可以通過多種趨化因子作用遷移到炎癥部位。NK細胞可以不依賴于樹突狀細胞的抗原遞呈作用，清除MHC-I分子陰性的腫瘤細胞以及被病毒感染的細胞。因此NK細胞逐漸成為腫瘤免疫治療領域的熱點，用于控制腫瘤細胞的生長和轉移[1]。然而由于缺乏有效的NK細胞體外擴增手段，影響NK細胞在腫瘤過繼細胞免疫治療中的治療效果。因此，應用更加有效的方法提高NK細胞的數(shù)量及活性是臨床急需解決的問題。

目前常用的NK細胞體外擴增方式為使用多種細胞因子的聯(lián)合刺激。白細胞介素（interleukin, IL）IL-2+IL-15的聯(lián)合刺激是體外擴增NK細胞的常用方案，IL-15可以維持NK細胞的分化和擴增，抵抗IL-2介導的NK細胞凋亡[2-3]。IL-2可以促進NK前體細胞和NK成熟細胞的生長，增加NK細胞分泌的細胞溶解酶的表達量，增強NK細胞毒性[4]。此外，IL-12和IL-18也常用于NK細胞的體外培養(yǎng)。不同于IL-2和IL-15，IL-12通過促進NK細胞釋放干擾素γ（interferon gamma, IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α），從而達到抑制腫瘤血管新生以及通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）和細胞凋亡因子配體（fas ligand, FasL）介導腫瘤細胞凋亡的效果[5]；IL-18能夠通過上調NK細胞表面IL-12受體（IL-12 receptor, IL-12R）的表達，增強IL-12效果[6-7]。然而如何優(yōu)化細胞因子組合方式、添加時間點進而使得NK細胞的體外擴增達到最佳效果，現(xiàn)有的研究并沒有一致的結論[8-10]。本研究選取IL-2、IL-12、IL-15和IL-184種細胞因子的3種不同組合和添加方式，對健康志愿者或腫瘤患者的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）進行體外培養(yǎng)，并分析所得NK細胞的擴增倍數(shù)、細胞表型以及對腫瘤細胞的殺傷活性，以找到一種最有效的NK細胞體外培養(yǎng)方案。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Thermo Fisher公司，ALyS505NK-AC、ALyS505NK-EX培養(yǎng)基和CD16抗體購自日本株式會社細胞科學研究所，rhIL-2、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-18購自美國Pepro Tech公司，流式抗體CD3-FITC、CD25-PE、CD45-PerCP、CD56-PE購自美國BD Biosciences公司，CFSE購自日本同仁化學研究所，7-AAD購自美國Bio Legend公司，淋巴細胞分離液購自天津市瀚洋生物制品科技有限責任公司，腫瘤細胞株K562購自上海中科院細胞庫，ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

健康志愿者5例，年齡26～43歲?；羝娼鹆馨土龌颊?例，年齡分別為46歲和59歲。采集外周血50 ml，使用淋巴細胞分離液分離PBMCs。使用NK細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細胞因子添加方式如下：A組（IL-2+IL-15聯(lián)合添加），第1天，用CD16抗體包被的T25培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，加入7 ml NK細胞初始培養(yǎng)基（含10%滅活人自體血清的ALyS505NK-AC培養(yǎng)基，并加入rhIL-21000 u/ml、rhIL-1520 ng/ml）；每3天補液，第14天，收集細胞進行后續(xù)表型和功能實驗。B組（IL-2+IL-12+IL-15+IL-18聯(lián)合添加），其他操作過程與A組相同，rhIL-12添加濃度為10 ng/ml，rhIL-18添加濃度為50 ng/ml。C組（IL-12+IL-15+IL-18預處理/IL-2）：先使用細胞因子rhIL-12（10 ng/ml）+rhIL-18（50 ng/ml）+rhIL-15（1 ng/ml）預處理16 h，然后PBS洗滌2次，之后再按照與A組相同的方式進行后續(xù)培養(yǎng)，只添加rhIL-2（1000 u/ml）。

腫瘤細胞株K562用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，于37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 檢測細胞表型

收集培養(yǎng)7和14 d的各組NK細胞，將細胞濃度調為1×107個/ml，標志熒光抗體CD3-FITC、CD45-PerCP、CD56-PE，各組設同型IgG陰性對照，4℃避光孵育30 min后，PBS漂洗2次，然后使用流式細胞儀進行檢測分析。對于CD25的檢測，細胞孵育CD25-PE熒光抗體，方法同上。

1.4 ELISA檢測IFN-γ的釋放

取培養(yǎng)14 d后的NK細胞作為效應細胞，K562細胞為靶細胞，按照10∶1的比例在96孔板中進行共培養(yǎng)，每組NK細胞做3個復孔。共培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書操作方法進行檢測。

1.5 NK體外殺傷K562腫瘤細胞實驗

NK細胞培養(yǎng)至第14天時，收集細胞進行CFSE標記。主要操作步驟如下：收集NK細胞并計數(shù)，使用CFSE標記緩沖液（生理鹽水+1% FBS）洗滌1次，并重懸細胞（細胞密度為1×107個/ml）；加入CFSE（終濃度為200 nmol），置于37℃細胞培養(yǎng)箱孵育15min，生理鹽水洗滌2次，并用NK細胞培養(yǎng)基重懸細胞。在6孔板中加入0.5 ml K562細胞（1×105個/孔），然后按比例（5∶1、10∶1和20∶1）加入標記好的NK細胞（總體積為1 ml），同時設置只有NK細胞或K562細胞的對照孔，置于培養(yǎng)箱共培養(yǎng)4 h。

收集共培養(yǎng)的細胞，使用7-AAD染色法檢測K562細胞的死亡率，主要操作如下：離心收集細胞，棄上清，加入100 μl染色緩沖液重懸細胞，然后加入5 μl 7-AAD混勻，室溫避光放置15 min。同時設置不加7-AAD的陰性對照。然后加入400 μl染色緩沖液，使用流式細胞儀進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差分析差異有統(tǒng)計學意義后，再采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞因子預處理對NK細胞擴增能力的影響

分別在細胞培養(yǎng)過程中的第7天和第14天取樣，離心棄上清，加入適量PBS重懸后用血細胞計數(shù)板計數(shù)。計數(shù)統(tǒng)計結果見圖1A所示，在第7天時，A、B、C組中細胞擴增倍數(shù)分別為（25.726±5.057）、（26.156±6.106）和（29.471±7.616），各組間差異無統(tǒng)計學意義（F=0.313，P=0.743）。第14天時，3組細胞擴增倍數(shù)分別為（92.637±10.522）、（104.939±12.414）和（114.361±15.825），雖然C組的細胞擴增倍數(shù)略高于A和B組，但是組間差異無統(tǒng)計學意義（F=2.073，P=0.207）。由于現(xiàn)有的NK體外擴增方法得到的細胞除了NK以外，還有一定數(shù)量的T細胞和NKT細胞，因此使用流式細胞儀的方法檢測樣品中CD3和CD56的表達情況，并對其中NK細胞（CD3-CD56+）比例進行了統(tǒng)計學分析，結果顯示隨著培養(yǎng)時間的延長，各組培養(yǎng)方式下NK細胞比例也不斷增加，第7天時NK細胞比例分別為（31.048±4.428）%、（37.965±2.560）%和（40.277±5.229）%，第14天時NK細胞比例分別為（54.375±6.803）%、（57.033±6.773）%和（62.697+6.232）%（見圖1B），但是各組間NK細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（F=3.879和1.241，P=0.083和0.354）。以上結果表明，細胞因子預處理的培養(yǎng)方式（C組）能較好的擴增NK細胞，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方式（A和B組）的擴增能力相當。

2.2 細胞因子預處理對NK細胞活性的影響

在第7天時取樣進行流式細胞儀檢測，細胞因子預處理的方式C組可以提高CD25（IL-2Rα）的表達（陽性率為69.1%），而A和B組培養(yǎng)方式幾乎不能誘導CD25的表達（見圖2A）。ELISA檢測NK細胞與靶細胞（K562）共培養(yǎng)后上清中IFNγ的釋放情況，結果顯示各組細胞的IFNγ釋放量分別為（43.2±8.7）、（63.4±10.3）和（137.4±17.5）ng/ml，經(jīng)單因素方差分析各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=32.490，P=0.001）。進一步兩兩比較表明，與A和B組比較，C組中細胞IFNγ釋放量較多（t=6.982和5.151，P=0.002和0.007），而A和B組細胞間IFNγ釋放量無明顯變化（t=2.609，P=0.060）（見圖2B）。

圖1 3種培養(yǎng)方式的擴增倍數(shù)和NK細胞比例

2.3 細胞因子預處理對NK細胞殺傷能力的影響

采用體外殺傷實驗進一步證實NK細胞的活性。首先，使用CFSE標記效應細胞（Effector, E），結果顯示200 nmol的CFSE可以很好的標記NK細胞（陽性率為＞99%），并且?guī)缀醪粫K細胞產(chǎn)生毒性（見圖3A）。然后，將標記過的NK細胞與靶細胞K562（Target, T）按照5∶1、10∶1和20∶1的比例共培養(yǎng)，并通過7-AAD染色的方法統(tǒng)計K562細胞的死亡率，C組的NK細胞殺傷K562細胞的流式細胞儀檢測結果見圖3B（E∶T=5∶1）。對各組細胞在不同比例下的殺傷結果進行統(tǒng)計學分析，顯示預處理方式得到的NK細胞的殺傷能力最強，各比例下的殺傷率分別為（27.967±9.434）%、（65.233±9.069）% 和（82.967±6.804）%，并且在10∶1和20∶1的比例時，各組細胞殺傷率之間差異有統(tǒng)計學意義（F=8.416和9.191，P=0.018 和 0.015）（見圖 3C）。

2.4 腫瘤患者NK細胞擴增效果

從2例霍奇金淋巴瘤患者的外周血中分離PBMCs，然后使用細胞因子預處理的方法進行NK細胞的擴增培養(yǎng)，14 d后取樣分析NK細胞的得率。流式細胞儀分析結果顯示（見圖4），2例腫瘤患者PBMCs均能成功擴增NK細胞（CD3-CD56+），其陽性率分別為62.63%和50.24%，而其他細胞（T細胞和NKT細胞）的比例較低。

圖2 3種培養(yǎng)方式下CD25的表達及NK細胞釋放IFNγ的比較

圖3 3種培養(yǎng)方式下NK細胞殺傷活性的比較

圖4 腫瘤患者NK細胞的擴增效果

3 討論

IL-12、IL-15、IL-18等細胞因子對NK細胞的功能具有重要的作用。在NK細胞培養(yǎng)過程中添加不同種類的細胞因子，從而發(fā)展出多種培養(yǎng)方法[11]。不同的細胞因子組合和劑量等略有不同，而添加方式通常為持續(xù)添加。在體外擴增過程中持續(xù)添加細胞因子不但增加了培養(yǎng)成本，而且由于IL-12細胞因子會造成嚴重的不良反應，因此要限制IL-12在NK細胞培養(yǎng)過程中的使用量以及殘余量。有研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，IL-12、IL-15和IL-18可能是通過促進IFN-γ mRNA的合成以及蛋白質的表達參與NK細胞早期的免疫應答，并不涉及NK細胞的生長及活性維持。本研究探索了使用細胞因子預處理的培養(yǎng)方法，先使用IL-12、IL-15和IL-183種因子刺激16 h，然后使用只添加IL-2的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。結果顯示IL-12、IL-15和IL-18預處理的培養(yǎng)方法能很好地擴增NK細胞，細胞擴增倍數(shù)和NK細胞比例與傳統(tǒng)的持續(xù)添加細胞因子的培養(yǎng)方式相當。NK細胞的生長依賴于IL-2信號通路，而IL-2的復合體形式?jīng)Q定了信號通路的敏感性，以及細胞因子刺激NK細胞活性的能力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-12、IL-15和IL-18預處理能上調細胞表面CD25（IL-2Rα）的表達，從而NK細胞表面可形成IL-2Rα/β/γ復合體，大大提高NK對于細胞因子刺激的敏感性，降低了細胞因子的使用量。值得注意的是，預處理的培養(yǎng)方式獲得的NK細胞的活性（IFNγ的釋放量和體外殺傷K562腫瘤細胞的能力）顯著提高。此外，IL-12+IL-15+IL-18預處理的培養(yǎng)方法還能夠有效擴增腫瘤患者自身的NK細胞。因此，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)方式下擴增的NK細胞，使用IL-12、IL-15和IL-18預處理的培養(yǎng)方式得到的NK細胞在臨床上具有更大的優(yōu)勢。